，用70%乙醇表面消毒30s，再以0. 1% HgCl2 處理15min，用無菌水沖洗3-5遍。用30ml無菌水培養(yǎng)2h (25°C，120rpm)，再經(jīng)無菌水沖 洗1-2遍后用無菌濾紙吸干表面水分，放置在NMB2培養(yǎng)基（愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基）上，暗 處培養(yǎng)9d(25°C )。將盾片誘導(dǎo)的淡黃色顆粒狀愈傷組織從胚乳上切下，轉(zhuǎn)移至新的NMB2 培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)2-3代以后（繼代周期為18d)，將淡黃色胚性愈傷組織轉(zhuǎn) 入RNMB培養(yǎng)基（分化培養(yǎng)基）中，培養(yǎng)30d左右后會(huì)分化出芽。將再生芽置于PMS培養(yǎng) 基（生根培養(yǎng)基）上生根，最終成長為完整植株（分化和生根培養(yǎng)時(shí)環(huán)境：16/8-h light/ dark，2500-30001x，22-25°C )。（2)挑取帶有單子葉植物過表達(dá)載體pUN1301-TaHMA2的農(nóng) 桿菌AGLl的單菌落，接種到5mlLB液體培養(yǎng)基中（Rif +，Kan+),過夜培養(yǎng)（28°C，200rpm)。 取活化過夜的農(nóng)桿菌，按1 : 40的比例稀釋至20ml LB液體培養(yǎng)基中（Rif，Kan)，繼續(xù) 培養(yǎng)5-6h (0D6。。= 0· 6-0. 8)。離心（5000rpm，5min)，收集菌體。用AAM液體培養(yǎng)基重懸 菌體，稀釋10倍，OD6。。調(diào)至0. 02左右，然后繼續(xù)培養(yǎng)30min(28°C，150rpm)，以備侵染用。 (3)取繼代培養(yǎng)2-3次，形狀和大小規(guī)則的淡黃色胚性愈傷組織作為侵染的外植體。將外 植體置于新鮮的NMB2培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2-3d。將預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織用上述備好的AAM農(nóng) 桿菌液（〇D_ = 0. 02)侵染8min，用無菌濾紙吸干愈傷組織表面的液體，轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培 養(yǎng)基（NMB2-As)上，暗培養(yǎng)2d(25°C )。共培養(yǎng)后的愈傷組織先用無菌水沖洗5次，再用 含抗生素（Cef500mg · 1 3的無菌水沖洗4次，每次IOmin ;最后用NMB2液體培養(yǎng)基（含 CeKOOmg · 1 3沖洗1-2次。用濾紙吸干愈傷組織表面的液體，于超凈工作臺(tái)中吹干（約 需40min)，先轉(zhuǎn)移到前培養(yǎng)培養(yǎng)基（NMB2-C ef，不含Kan)中培養(yǎng)7d，然后再轉(zhuǎn)移至抗性篩 選培養(yǎng)基（NMB2-Kan)中培養(yǎng)，繼代周期為20d。第1代篩選時(shí)，培養(yǎng)基中潮霉素濃度為 25mg · 1 \以后繼代時(shí)升至50mg · I \篩選培養(yǎng)3-4代后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng) 基（RNMB-Kan)中，暗培養(yǎng)3d，然后至光下繼續(xù)培養(yǎng)。待抗性芽長至2-5cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生 根培養(yǎng)基（PMS-Cef)中培養(yǎng)。生根苗長至8-lOcm時(shí)即可移栽。本部分所用培養(yǎng)基成分見 表4。
[0060] 表4水稻組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基
[0061]
[0063] 步驟3:組織化學(xué)鑒定⑶S酶活性（見附圖4)。⑶S組織化學(xué)染色用底物為 X-gluc (染色液配制見表5)。將待測植物材料浸泡于X-Gluc染色液中，抽真空15min，37°C 反應(yīng)l-6h。棄去染色液，95%乙醇脫色，鏡檢。
[0064] 表5⑶S檢測液的配制
[0065]
[0066] 實(shí)施例6啟動(dòng)子、啟動(dòng)子與第一內(nèi)含結(jié)合序列啟動(dòng)報(bào)告基因 GUS在擬南芥中的表 達(dá)研究
[0067] 步驟1 :將pCAMBIA1301-P和pCAMBIA1301-PF表達(dá)載體利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 C58C1。
[0068] 步驟2 :利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸泡法將上述載體轉(zhuǎn)入擬南芥（見附圖3)。（1)攜 帶重組質(zhì)粒 pBI121-TaHMA2 的農(nóng)桿菌 C58C1 在 LB 平板（Kan50y g .ml ^GentSSy g .ml 3 上劃單菌落，28 °C培養(yǎng)約48h。挑取單菌落于2mlLB液體培養(yǎng)基（Kan50 μ g · ml \ Gent25 μ g · ml 3中，振蕩培養(yǎng)約12h (28°C，200rpm)。將該2ml菌液轉(zhuǎn)入200mlLB液體培 養(yǎng)基（Kan50y g .ml ^GentSSy g ·ι?1 3 中，繼續(xù)培養(yǎng)至 0D6。。= 0· 8-1. 0(28°C，250rpm，約 需1210，離心（300(^，101^11)收集菌體，然后用擬南芥轉(zhuǎn)化滲透液（5%蔗糖，0.03-0.05% silwet)重懸，調(diào)節(jié)OD6。。值為0.8左右，用于擬南芥的侵染。（2)擬南芥種子表面消毒后在 1/2MS固體培養(yǎng)基上春化（4°C) 2d，萌發(fā)一周后移栽于土中（營養(yǎng)土 ：蛭石=1 : 3)，于溫 室中培養(yǎng)（22'€，16/8-111丨8111:/(^11〇，可每14(1燒一次營養(yǎng)液。待抽薹高約8〇11，且花蕾較 多時(shí)用于轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化時(shí)間最好選在上午，轉(zhuǎn)化前Id澆足水分）。（3)將擬南芥花序浸入上 述備好的菌液中，靜置3min，然后將擬南芥植株平放在暗處，用塑料袋保濕，共培養(yǎng)24h后 揭開，繼續(xù)在溫室中正常培養(yǎng)。將收獲的種子表面消毒，播于擬南芥1/2MS固體培養(yǎng)基上 (Kan50 μ g · ml \ Cef250 μ g · ml 4，4°C春化2d后于溫室中培養(yǎng)，能正常生長的為抗性苗， 14d后將抗性苗移入營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0069] 步驟3 :GUS酶活性的組織化學(xué)鑒定（見附圖5)，方法同實(shí)施例5。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一個(gè)小麥TaHMA2基因的啟動(dòng)子，核苷酸序列如下所示： CGCTGCCTGATGAGTTGCCACGGCTAGGTATAGATGGAGGCGTGGGGCGATGTACGAGTAGATAGTTATGGG CCGATCATCATCCCTATACCTGTACATGTATACGACGTGTATACGCGGGATATCCTTCTTTTCACTAGCACTATTCA TCTCTCACAATCTAGTCCCTAGCCATTTTTTGTCAAGAAAAAGTCAACTTTGCAGTTATAATCAAAGTCCAACGAAC TTAATAATAAATTGTCAATTTCCTCAAAAAGAAAAGGCTTAACCATGCGTGGCCCAGACGGAAAACTAAACGGGCCA GTTGGTGTAGCCACGGGGAGGTTTGCCTCTCTCGCGCGGCTTTCCGGGATCACGCACGCACGCACGCTGAGTCGCTA ACCGTGGTTCATCACGGCTCTCCCTCTCGCCTTCCTCCGATCTGCGTCGGACTCCGCCCGGAATCCCAGTGCCCGCT CCGTCATCATCCACTGATCCGCCCGTAGCACCCCCACGCCGCTGTCCGTGCAAAAATGCTAGATACACGGACTATCT CGACGGGCTTTTACGGACCAGCTGACCTGTCCTTCTTTAATTGGGCTAACTAACCTTCTTCTCCTAATTAATCGGTC CCCCTGATTTTAACTGGTGGGGGTGGGCGCCAAGCCCTGTAAAACCCCGTAATAGCCCGTGGATGTAGCAAAGCCGC TGTCCGTGTCCTGCACCCCGCTCTGCCCGGCCTTAAATACGCGCCCCCCTGCCTCTGCACCCTCGTCTTCTCCTCCT CCTCCTTCCGCTCCGCGCTTCCTGCCATCATCCGCGAGGTAGGTGGGTTTGCCAGTTAATGGCGGCCGAACAAATTT TCGTCAGCGCCTCCGCCCAAGCCTGAACCTACCACCATATATACATCACCAACACCGCACGCCAAGATTGCTCTGCT CTGCTCACCACTCTTCTTGGCTCTCTTGCCGCCGTGTCGCGCGCAGGCAGAGGGGTGGCGGCGGCAGGTGAGGCGCG CAAAGAAGCGGGAGCGGAAGAGCCTGGCCACTCGACGGGAGGGAGCG 〇2. -個(gè)小麥TaHMA2基因的第一內(nèi)含子，核苷酸序列如下所示： GTAAGCAAGCACACAATCCTCCTCCTCCTCCTCATCCTCTCGCTTTCCCCCGAGATCCCTCTCCCTCGCCGT CGCGCTCGGCCCTCGTGACCGGGTCATCAACTTGTCTTGTTCCTTCGCTCGCCTCGTATGCGCCGGTGAATTTTTTG TCCGTTACCCCGGATGTTCAGGTGAAAACTGCTCGCTTTCGCCGCTGATCAACCTCTCCCCCCGTAATTCGTGGTTG TAATTTGCCGATTGACTCGACGGGAACCGGGGTCGCTGGACTTGGACTGGAACAGAACTGACCGGAGTCGCCGTTGA AACTGGTCCGGGTAAAACCGATCCGGCCTTTCTGGTAGTAGTAACGTGCTGCCCGCCTCATCACCCGGCCGTCCTCA TAAATTCTGATGACGACGGCCGGCGTGCACCGACGGGTTTGTTTGGCTTTAAAAAACGGCCGGCCGGCGTGAACCAA CTTCACCGTCGCCGGGCTACTGGATTATGGGTTTTGGGATTTAAAAAATATATATACATATCCAAACTTTGTTTATA CTTGCAGTTGCAGCGACGGAAGTACATATCGAACCACGTGAAGGATCACGCAAAGTCACTAATTCTTTTCTCATCAT CGAGCTTTGTTCTCTCCGAATTTCCTACGCTCTTTCCCTTCTTGTCTTGTCCTTGCTTTTTTTTACTGATTTTCAGT ATAGTTTTTTTCTTCACTTTTTGCCATATCTGTTCGTTCACAGAAAATTCTGATTATTATCACAGTAAATAAAATTA TGGATTTCACAATTATTTACGTAATCATTTTTTATTTTTTATTATCCTCTGGAACTGTAAATTCTATCTATCCGCGA TTCCAGCGTGACTATAACAATATCTCTTTTTTTTTTCTATCCTGCAG 。3. 含有權(quán)利要求1和2所述的啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-P、 pCAMBIA1301-PF、pCAMBIA1301-F(附圖 2)。4. 含有權(quán)利要求3所述的三個(gè)植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌（AGLl和C58C1)轉(zhuǎn)化子。5. -種權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中驅(qū)動(dòng)目的基因特異性表達(dá)的用途。6. -種權(quán)利要求2所述的內(nèi)含子在轉(zhuǎn)基因植物中驅(qū)動(dòng)目的基因特異性表達(dá)的用途。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其植物材料優(yōu)選水稻。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其植物材料優(yōu)選水稻和擬南芥。
【專利摘要】本發(fā)明涉及小麥TaHMA2基因的啟動(dòng)子及其具有啟動(dòng)子活性的第一內(nèi)含子。該啟動(dòng)子、啟動(dòng)子+內(nèi)含子、內(nèi)含子均可強(qiáng)烈啟動(dòng)報(bào)告基因GUS在水稻中表達(dá)，且表達(dá)具有明顯的組織特異性(如維管組織較多的部位)；三者也可啟動(dòng)報(bào)告基因在擬南芥中表達(dá)，亦具有明顯的組織特異性(如莖節(jié)部位)，但表達(dá)活性較弱；該內(nèi)含子在花器官中基因的表達(dá)調(diào)控方面具有特殊作用。應(yīng)用本發(fā)明的啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子進(jìn)行植物的轉(zhuǎn)基因研究或開發(fā)具有重要的應(yīng)用價(jià)值，尤其是在植物營養(yǎng)物質(zhì)的長距離運(yùn)輸和累積領(lǐng)域。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/82, C12N15/113, C12N1/21
【公開號】CN105018491
【申請?zhí)枴緾N201410155904
【發(fā)明人】柴團(tuán)耀, 譚金娟, 馮珊珊, 柴興蘋, 陳煜嫻
【申請人】中國科學(xué)院大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2014年4月18日