30分鐘后，棄上清，取沉淀；沉淀用20mM PB緩沖液溶解，并過0.45 μ m濾膜，取液體得菌絲霉素蛋白溶解液。
[0017]將菌絲霉素蛋白溶解液經(jīng)Sephadex G25層析脫鹽，再經(jīng)陽離子交換層析CM柱進一步純化。蛋白掛柱后，用0.3mM NaCl洗脫雜質(zhì)蛋白(不含菌絲霉素)，用0.5mM NaCl洗出目的蛋白(含有菌絲霉素)，將0.5M NaCl洗脫液溶液進行反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，RP-HPLC色譜圖如圖1所示。從中可以看出，純化后的菌絲霉素蛋白純度很高，可達到90%以上，為藥用級。
[0018]3)質(zhì)譜鑒定
對上述純化后的菌絲霉素蛋白進行質(zhì)譜檢測，檢測結(jié)果如圖2所示。從質(zhì)譜圖中可以看出在4414.8062處有最高峰，與理論分子量一致，說明純化后的蛋白的確為菌絲霉素蛋白。
[0019]實施例2菌絲霉素蛋白對痤瘡丙酸桿菌的抑制作用 I)對金黃色葡萄球菌26003的抑菌效果
取上述高效液相色譜純化后的菌絲霉素蛋白，配成濃度為I μ g/ μ L，點樣到含有金黃色葡萄球菌26003的瓊脂平板上；同時，平板中還點有氨芐青霉素Amp和無菌水分別作為陽性對陰性對照；具體設(shè)置情況如圖3所示，I為20 μ L的lug/uL菌絲霉素蛋白；2為40 μ L的I μ g/μ L菌絲霉素蛋白；3為60 μ L的的I μ g/μ L菌絲霉素蛋白；4為80 μ L的的I μ g/μ L菌絲霉素蛋白；5、為10yL的的I μ g/μ L菌絲霉素蛋白；“6”為無菌水，作為陰性對照；“7”為氨芐青霉素Amp，作為陽性對照；37°C過夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果。
[0020]結(jié)果如圖3所示，所有點有不同體積菌絲霉素溶液和氨芐青霉素地方均出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，而點有無菌水處無抑菌圈，說明菌絲霉素具有抑金黃色葡萄球菌26003的作用。
[0021]2)對痤瘡丙酸桿菌ATCC 11827的抑菌情況
取上述高效液相色譜純化后的菌絲霉素蛋白，配成濃度為I μ g/ μ L，點樣到含有痤瘡丙酸桿菌ATCC 11827的瓊脂平板上；同時，平板中還點有氨芐青霉素Amp和無菌水分別作為陽性對陰性對照；具體設(shè)置情況如圖4所示，37°C過夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果。
[0022]結(jié)果如圖4所示，所有點有不同體積菌絲霉素溶液地方均出現(xiàn)了與陽性對照一樣明顯的抑菌圈，而點有無菌水處無抑菌圈，說明菌絲霉素具有抑痤瘡丙酸桿菌的作用。
[0023]實施例3菌絲霉素在制備治療痤瘡藥劑中的應(yīng)用一種治療痤瘡的菌絲霉素凝膠劑
1.一種治療痤瘡的菌絲霉素凝膠劑的配方為:菌絲霉素0.005%，卡波姆940 0.8%，甘油8%，尼泊金甲酯0.1%，尼泊金丙酯0.05%，三乙醇胺1.5%，余量為水，其中百分比均指質(zhì)量百分比。
[0024]2.一種治療痤瘡的菌絲霉素凝膠劑的制備方法:
將菌絲霉素蛋白用少量蒸餾水溶解備用；按照配方中的含量將尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、甘油加入余下的蒸餾水中，加熱溶解，然后加入卡波姆940，約24h使其充分溶脹，適量攪拌，加入三乙醇胺，調(diào)節(jié)pH值至6，加入菌絲霉素蛋白溶液，攪拌均勻，制成凝膠1000g，即為菌絲霉素凝膠劑。
[0025]3.菌絲霉素凝膠劑治療人體皮膚痤瘡的效果檢測
方法:將上述制備的菌絲霉素凝膠劑用于治療人體痤瘡，選擇面部有痤瘡的患者20人，早晚各涂抹一次，每次涂抹1mL于患處；連續(xù)涂抹20天，對比治療前后的效果，統(tǒng)計具有治療效果的人數(shù)。
[0026]結(jié)果:連續(xù)治療20天后，具有治療效果的人數(shù)達16人，占80%。治療前后的對比圖如圖5和圖6所示。
[0027]圖5為本發(fā)明菌絲霉素凝膠劑治療面部痤瘡前后的對比圖'K、B分別為痤瘡患者正面治療前后對比圖；C、D為左側(cè)面治療前后的對比圖；E、F為右側(cè)面治療前后的對比圖；其中B、D、F為紅色區(qū)圖片，以觀察皮下毛細血管分布情況；痤瘡越多皮下毛細血管越密集不均勻；從中可以明顯看到治療前患者皮下毛細血管較治療后更加密集和不均勻。
[0028]圖6為另一患者用本發(fā)明菌絲霉素凝膠劑治療面部痤瘡前后的對比圖；A、B分別為痤瘡患者正面治療前后對比圖；C、D為左側(cè)面治療前后的對比圖；E、F為右側(cè)面治療前后的對比圖；其中B、D、F為紅色區(qū)圖片，以觀察皮下毛細血管分布情況；從中可以明顯看到治療前患者皮下毛細血管較治療后更加密集和不均勻。
[0029]上述結(jié)果說明菌絲霉素和菌絲霉素凝膠劑對痤瘡具有很好療效，其中凝膠劑抗菌消炎作用更好，由于凝膠的膠黏特性，作用時間和保濕效果持久，并能有效的隔絕作用部位與空氣的接觸，避免炎癥部位接觸空氣引發(fā)感染。使用方便，無需清洗。
[0030]為本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明專利的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均落在本發(fā)明要求的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種菌絲霉素蛋白的表達方法，其特征在于:包括以下步驟: . 1)根據(jù)菌絲霉素NZ2114的蛋白序列SEQID NO: 1，合成優(yōu)化的編碼菌絲霉素NZ2114蛋白的基因序列SEQ ID NO:2 ;將所得的菌絲霉素基因序列SEQ ID N0:2連接到酵母表達載體PPicZa的a -factor信號肽下游的多克隆位點，將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GSl 15中，篩選出陽性重組菌； .2)將上步篩選出的陽性重組菌進行誘導表達培養(yǎng)，提取并純化所表達的目的蛋白，即為菌絲霉素蛋白。2.菌絲霉素蛋白在制備抑痤瘡丙酸桿菌藥劑中的應(yīng)用。3.菌絲霉素蛋白在制備治療痤瘡藥劑中的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的痤瘡為由痤瘡丙酸桿菌引發(fā)的痤瘡。5.一種治療痤瘡的菌絲霉素凝膠劑，其特征在于:該菌絲霉素凝膠劑由以下質(zhì)量百分比的成分組成:菌絲霉素0.001%?0.01%，卡波姆940 0.5%?1.0%，甘油5%?10%，尼泊金甲酯0.05%?0.20%，尼泊金丙酯0.01%?0.1%，三乙醇胺1.0%?2.0%，余量為水。6.一種治療痤瘡的菌絲霉素凝膠劑的制備方法，其特征在于:包括以下操作步驟: . 1)將菌絲霉素蛋白用蒸餾水溶解備用； .2)尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、甘油加入到蒸餾水中，加熱溶解完全，然后加入卡波姆.940，使其充分溶脹，攪拌均勻，加入三乙醇胺，調(diào)節(jié)pH值至5.8?6.2，最后加入菌絲霉素蛋.白溶液，攪拌均勻，即可獲得治療痤瘡的菌絲霉素凝膠劑； 上述所制得的菌絲霉素凝膠劑中含有以下質(zhì)量百分比的成分:菌絲霉素0.001%?.0.01%，卡波姆940 0.5%?1.0%，甘油5%?10%，尼泊金甲酯0.05%?0.20%，尼泊金丙酯.0.01%?0.1%，三乙醇胺1.0%?2.0%，余量為水。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種菌絲霉素蛋白的表達方法及其在抑痤瘡丙酸桿菌中的應(yīng)用。本發(fā)明將所得的菌絲霉素基因序列SEQ？ID？NO:2連接到酵母表達載體pPicZα的α-factor信號肽下游的多克隆位點，將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，篩選出陽性重組菌；進而融合分泌表達所需的菌絲霉素蛋白。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)菌絲霉素具有抑制痤瘡丙酸桿菌的作用，可用于制備痤瘡丙酸桿菌的抑菌劑；可進一步用于治療痤瘡等皮膚炎癥，尤其是對目前難以治療的由痤瘡丙酸桿菌引發(fā)的痤瘡等皮膚炎癥具有良好的療效。本發(fā)明將純化后得到的菌絲霉素蛋白，以一定的濃度，再添加其他鋪助成分，制備成外用制劑，用于治療尋常性痤瘡。
【IPC分類】C07K14/37, A61P31/04, A61K9/06, A61P17/10, C12N15/31, A61K38/16, C12N15/81
【公開號】CN105018516
【申請?zhí)枴緾N201510397908
【發(fā)明人】周玉巖, 孫丹丹, 黃亞東, 張敏靜, 項琪, 楊虹坤, 張齊
【申請人】廣東海納川生物科技股份有限公司, 廣州暨南大學醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月7日