淋病奈瑟菌實時熒光pcr快速檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于淋病奈瑟菌實時熒光PCR快速 檢測試劑盒，可用于淋球菌感染的早期檢測，對淋病進行臨床輔助診斷。
【背景技術(shù)】
[0002] 淋病奈瑟菌（NG)簡稱淋球菌，是淋病的病原菌，其惟 一的宿主就是人類。淋病是危害較大的傳染性疾病之一，以血液傳播、性傳播、一般的體液 傳播及私人用品傳播為傳播途徑，是一種古老而又常見的性病。淋病以泌尿生殖系統(tǒng)化膿 性感染為主要表現(xiàn)，主要發(fā)生在尿道和子宮頸粘膜，也可累及眼、咽、直腸和盆腔，可損害生 殖系統(tǒng)及全身其他器官，嚴重者可導致不孕不育。而且淋病感染后的潛伏期（14天以內(nèi))癥 狀不明顯，一旦過了潛伏期，就具有了明顯癥狀，若不及時診治，會導致嚴重的泌尿生殖疾 病等，所以應(yīng)及早對淋病進行診斷及治療。
[0003] 近年來淋病的發(fā)病率呈直線上升趨勢，發(fā)病率居中國性傳播疾病首位，而且多發(fā) 于青壯年。此外，淋球菌感染可增加艾滋病感染的風險達5倍以上。因此，淋病不僅嚴重危 害患者的身心健康，而且影響了社會的穩(wěn)定及精神文明建設(shè)，所以做好淋病的防治工作具 有重大的意義。而淋病的防治的關(guān)鍵在于NG感染的早期診斷，只有對可疑患者進行及時的 診斷，才能有效的治療和預(yù)防淋病。
[0004] 臨床上對于淋病的確診主要依靠 NG的檢測結(jié)果，而臨床檢測方法一般常用是直 接涂片染色法、分離培養(yǎng)法、快速檢測法及抗原檢測等等，但是這幾種方法在敏感性和特異 性上都有不足，容易漏檢。近年發(fā)展起來的PCR方法則具有靈敏度高，特異性強，且簡便省 時等特點，逐漸應(yīng)用于臨床樣本的輔助診斷，尤其是在原普通PCR的基礎(chǔ)上，發(fā)展起來的實 時熒光PCR技術(shù)，通過引入特異性探針和熒光信號的動態(tài)監(jiān)測使PCR產(chǎn)物的擴增及分析的 全過程可以再單管內(nèi)封閉完成，并且可以對PCR擴增產(chǎn)物進行實時動態(tài)監(jiān)測及自動分析結(jié) 果，避免了 PCR后的處理，是一種先進的分子定量檢測技術(shù)。
[0005] 目前市場已出現(xiàn)了多家以熒光PCR為基礎(chǔ)的NG診斷試劑盒，例如中山大學達安基 因股份有限公司，凱杰生物工程（深圳）有限公司，上海之江生物科技有限公司等。但是大 多以熒光探針法為主，由于要進行熒光物質(zhì)和淬滅物質(zhì)雙重標記，使得探針合成成本比較 高，影響其市場推廣以及病人承受能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種靈敏、準確、檢測成本低的淋病奈瑟菌實時熒光PCR快速 檢測試劑盒。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種淋病奈瑟菌實時熒光PCR快 速檢測試劑盒，包含PCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品、裂解液及蛋白酶 K溶液；PCR反應(yīng)液中包含了針對淋病奈瑟氏菌特異序列設(shè)計的正向引物、反向引物和SYBR Green I 染料； 正向引物序列為：5'_ ACCGAGCCACCCTCAGACT-3'， 反向引物序列為：5'_ GCCCAAATCCCCACCTT-3'， 裂解液包含 5. OmM Na0H、10.0 mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)、0· 2mM EDTA(pH8. 0)、 l%(V/V)TritonX-100,0. 5% (V/V)NP40,0. 5%(V/V)Tween20 ； 陽性質(zhì)控品與弱陽性質(zhì)控品是含插入淋病奈瑟氏菌特異性保守序列的PCR2. I載體質(zhì) 粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中增殖后經(jīng)提取純化、用分光光度計測定濃度和純 度后用無菌TE緩沖液定量稀釋；陰性質(zhì)控品是滅菌去離子水。
[0008] PCR反應(yīng)液還包含熱啟動Taq DNA聚合酶，dATP、dTTP、dGTP、dCTP四種核苷酸。
[0009] 上述正向引物、反向引物的衍生序列也為本發(fā)明的保護范圍，所述衍生序列包括 引物序列的互補鏈序列，同時還可以向5'端和3'方向延伸一至數(shù)個堿基或刪減一至數(shù)個 喊基得到的序列。
[0010] 本試劑盒保存于-20°c以下，盡量減少反復凍融。本發(fā)明即淋病奈瑟菌實時熒光 PCR快速檢測試劑盒，用于臨床樣本中淋病奈瑟氏菌的快速檢測，用于淋球菌感染的早期檢 測，用于淋病奈瑟氏菌感染的輔助診斷。
[0011] 本發(fā)明針對淋病奈瑟氏菌特異性基因保守序列設(shè)計特異性PCR引物，能特異性擴 增靶DNA序列，從而達到臨床診斷目的，可以簡便快速的檢測臨床樣本中淋病奈瑟氏菌感 染，具有特異性好、靈敏度高的特點。本發(fā)明與其它檢測技術(shù)相比主要具備以下優(yōu)點： 1、 相對于常規(guī)PCR技術(shù)，本產(chǎn)品具有操作簡便，結(jié)果明了等特點產(chǎn)物不要凝膠電泳檢 測，完全閉管操作，有效的減低了 PCR產(chǎn)物污染的風險； 2、 對于探針法熒光PCR技術(shù)，本產(chǎn)品采用SYBR Green染料法，價格低廉，有效 地降低了生產(chǎn)成本； 3、 檢測速度快，整個實驗操作僅需2-3個小時，操作簡單； 4、 用于淋球菌感染的早期檢測，盡早診斷治療。
[0012] 總之，本發(fā)明的試劑盒具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、快速明了、價格低廉等 優(yōu)點；同時閉管操作，減少后續(xù)反應(yīng)產(chǎn)物帶來的污染的可能性，是一種適用于臨床樣本中淋 病奈瑟氏菌的快速檢測的試劑盒。
【附圖說明】
[0013] 圖1是淋病奈瑟氏菌檢測試劑盒的靈敏度實驗數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標cycle表 示擴增循環(huán)數(shù)，縱坐標Λ Rn表示熒光強度，S1-S6分別表示濃度為5. OXlO4c0Pies/ μ 1>5. OX IO3Copies/ μ 1>5. OX IO2Copies/ μ 1>5. OX IOcopies/ μ 1>5. Ocopies/ μ 1> 5. OX 10 kopies/y 1的陽性指控品的擴增曲線，各3個重復數(shù)據(jù)，CK為陰性質(zhì)控品； 圖2是淋病奈瑟氏菌檢測試劑盒的特異性實驗數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標cycle表示擴增循 環(huán)數(shù)，縱坐標Λ Rn表示熒光強度，A代表NG陽性質(zhì)控品擴增曲線，B代表特異性參考品擴增 曲線和陰性指控品擴增曲線，特異性參考品分別為大腸埃希菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎克 雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、白色念珠菌、糞腸球菌與沙眼衣原體； 圖3是淋病奈瑟氏菌檢測試劑盒的陰性實驗數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標cycle表示擴增循環(huán) 數(shù)，縱坐標Λ Rn表示熒光強度，A代表NG陽性質(zhì)控品擴增曲線，B代表20個無菌去離子重 復樣本的擴增曲線； 圖4是淋病奈瑟氏菌檢測試劑盒的精密度實驗數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標cycle表示擴增循 環(huán)數(shù)，縱坐標Λ Rn表示熒光強度，SO為10份濃度為5. OX IO5Copies/μ 1的陽性參考品擴 增曲線，S4為10份濃度為5.0X10C〇pies/l·! 1的陽性參考品擴增曲線，CK代表陰性質(zhì)控 品； 圖5是淋病奈瑟氏菌檢測試劑盒的檢測限實驗數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標cycle表示擴增循 環(huán)數(shù)，縱坐標Λ Rn表示熒光強度，S5為20份濃度為5. Ocopies/ μ 1的NG陽性參考品擴增 曲線，CK表示陰性質(zhì)控品。
【具體實施方式】
[0014] 本試劑盒采用SYBR Green染料法熒光PCR檢測技術(shù)，快速檢測臨床樣品中淋球菌 特有序列，從而判斷淋球菌的存在。對保守序列我們共設(shè)計多對引物，并對其進行實驗驗 證，最后選擇了靈敏度高、特異性好的一對引物。下面實施例中未說明的常規(guī)方法和條件可 參考《分子克隆實驗指南》第三版或按照試劑制造商說明書中所建議的步驟和條件。
[0015] 實施例1試劑盒的制備 1、 試劑盒特異性引物的設(shè)計與合成 根據(jù)網(wǎng)上公布的NG序列（GenBank :AJ223446. 1)，針對淋球菌保守基因 PorA片段利用 生物學軟件Primer Premier 5軟件以及Oligo 7軟件對淋球菌PCR引物進行設(shè)計，并且用 軟件Mega4和NCBI在線Blast進行序列比對，保證每對引物特異性和合理性。引物委托寶 生物工程(大連）有限公司合成，采用PAGE純化，試劑盒特異性引物核苷酸序列如下： 正向引物：5'- ACCGAGCCACCCTCAGACT-3'， 反向引物：5'- GCCCAAATCCCCACCTT-3'， 2、 NG質(zhì)粒陽性質(zhì)控品的設(shè)計與制備 在上述NG特異性引物擴增序列的外圍序列，重新設(shè)計一對擴增引物，該引物擴增片段 能完全覆蓋住設(shè)計的NG特異性引物擴增區(qū)域。該外圍引物委托寶生物工程(大連）有限公 司合成，采用PAGE純化，該外圍引物核苷酸序列如下： 正向引物：5' -AACTTACCGCCCTCGTATTGTC-3'， 反向引物：5' -CCACATTATTATTGCTGTCCCA-3'， 采用該引物擴增的特異性核苷酸序列為： 5'-AACTTACCGCCCTCGTATTGTCCGCACTGCCGTTTGCGGCAGTTGCCGATGTCGGCCTGTACGGCGAAG TCAAAGCTGGTGTGGAAGGCAGGAACATCCGGCTGCAGTTGACCGAGCCACCCTCAGACTGTCAAACGGGCAATACA GTTACTAAGGCCAAAAGCCGCATCAGGACGAAAGTCAGTGATTTCGGCTCGTTTATCGGCTTTAAGTTGGTGGGGAT TTGGGCGGCGGGCTGAAGGCTGTTTGGCAGCTCGAGCAAGACGTATCCGTTGCCGGCGGCGGCGCGACCCGTTGGGG TAACAGGGAATCCTTTATCGGCTTGGCAGGCGAATTCGGCACGGCGCTCGCCGGTCGCGTTGCGAATCCGTTTGGCG ATGCCAGCAAAGCCATTGATCCTTGGGACAGCAATAATAATGTGG-3' 422bp 〇
[0016] 利用上述外圍引物和NG臨床陽性樣本DNA裂解液進行PCR擴增，將得到的PCR產(chǎn) 物純化后連接到質(zhì)粒PCR2. 1載體上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，通過藍白 斑初篩后，再經(jīng)過PCR鑒定為陽性的菌落，通過擴大培養(yǎng)后，提取陽性重組質(zhì)粒，經(jīng)雙向DNA 測序鑒定后，作為陽性質(zhì)控品的制備原料。
[0017] 質(zhì)粒pCR2. 1載體通過商業(yè)途徑獲得，購自于Invitrogen公司；大腸桿菌DH5 α感 受態(tài)細胞通過商業(yè)途徑獲得，購自于TAKARA公司。
[0018] 3、質(zhì)控品的制備 陽性質(zhì)控品由陽性質(zhì)控品的制備原料、采用TE緩沖液稀釋制備；陽性質(zhì)控品采用濃度 為1.0 X IO6C