opies/μ 1的重組質(zhì)粒；弱陽(yáng)性質(zhì)控品采用1.0 X IO2Copies/μ 1的重組質(zhì)粒； 陰性質(zhì)控品采用無(wú)菌去離子水。
[0019] 4、PCR反應(yīng)液的制備 引物的配置：將新合成的引物干粉離心1分鐘，加入適量無(wú)菌去離子水(根據(jù)合成量計(jì) 算)，將引物溶解成100 μ M的母液，使用時(shí)再將100 μ M的母液稀釋成10 μ M母液。PCR反應(yīng) 液的組成：20 μ 1的體系參考表1提供的各組分比例進(jìn)行配置。
[0020] 實(shí)施例2試劑盒的使用方法 1、樣本要求 a.樣本采集：高壓滅菌的特制拭子，伸入男性尿道口或女性宮頸口上l-2cm，旋轉(zhuǎn)一 周，停留約10秒后取出，將棉拭子頭放入盛有I ml無(wú)菌生理鹽水的樣本冷凍保存管中， 從頸部剪斷拭子，使拭子頭浸入鹽水中，反復(fù)漂洗，得標(biāo)本漂洗液。
[0021] b.存放：標(biāo)本漂洗液在_20°C以下保存，三個(gè)月內(nèi)無(wú)法檢測(cè)的樣本應(yīng)于_70°C以下 保存；標(biāo)本應(yīng)設(shè)專柜或?qū)?kù)單獨(dú)保存。
[0022] c.運(yùn)輸：采用冰壺加冰袋或泡沫箱加冰袋密封進(jìn)行運(yùn)輸。
[0023] 2、樣本制備 取500 μ 1標(biāo)本漂洗液，10, 000 rpm離心2分鐘，用移液器吸棄上清，保留沉淀；在 上述離心沉淀中加入50 μ I DNA裂解液(使用前確保將每49 μ I DNA裂解液中加入 1 μ 1蛋白酶Κ)，振蕩器上振蕩10秒后，于95°C沸水浴10分鐘，10, 000 rpm離心1分鐘， 取上清2μ 1樣本用于檢測(cè)；如果樣本裂解產(chǎn)物當(dāng)天不使用，則保存在-20°C及以下。
[0024] 3、樣本檢測(cè) 先在PCR準(zhǔn)備區(qū)，將PCR反應(yīng)液置室溫解凍混勻后按每管18 μ 1根據(jù)樣品數(shù)η (樣品 數(shù)=標(biāo)本數(shù)+ 3)進(jìn)行分裝；然后在樣本處理區(qū)依次向裝有PCR反應(yīng)液的各反應(yīng)管中分別加 入2 μ 1樣品，樣品包括樣本、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、弱陽(yáng)性質(zhì)控品，使反應(yīng)管總體系達(dá) 到20 μ 1，蓋嚴(yán)管蓋，混勻，低速離心數(shù)秒；轉(zhuǎn)移反應(yīng)管至檢測(cè)區(qū)，將反應(yīng)管按陰性對(duì)照、陽(yáng) 性對(duì)照及樣本次序，依次置于熒光PCR檢測(cè)儀（ABI St印One Plus)上，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增 反應(yīng)。
[0025] 4、熒光PCR儀的程序設(shè)置 按表2進(jìn)行熒光PCR儀的程序設(shè)置
5、參考值(參考范圍） 一般以儀器默認(rèn)值為準(zhǔn)，當(dāng)出現(xiàn)少數(shù)樣本擴(kuò)增曲線的噪音太大等特殊情況時(shí)可適當(dāng)調(diào) 整。ABI 7300或ABI St印One (Plus)基線設(shè)定：取3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)。閾值設(shè)定： 使閾值線超過(guò)正常陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線(無(wú)規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且CT值為Undet。
[0026] 6、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) a) 陰性質(zhì)控品：CT值=40或顯示為"Undet"，判斷為陰性； b) 陽(yáng)性質(zhì)控品：16 < CT值< 25,且有良好的擴(kuò)增曲線，判斷為陽(yáng)性； c) 弱陽(yáng)性質(zhì)控品：30彡CT值彡37,且有良好的擴(kuò)增曲線，判斷為陽(yáng)性。
[0027] 同時(shí)符合以上三個(gè)條件，判斷實(shí)驗(yàn)為"有效"。
[0028] 7、結(jié)果判斷 (1) 、樣品的CT=40或顯示為"Undet",判斷為陰性； (2) 、樣品的CT值彡37,判斷為陽(yáng)性； (3) 、若37〈CT值〈40,建議對(duì)待測(cè)樣本重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重新實(shí)驗(yàn)后，若CT值< 37,判斷 為陽(yáng)性，否則為陰性。
[0029] 實(shí)施例3試劑盒的性能評(píng)定 1、靈敏度實(shí)驗(yàn) NG靈敏度參比品（5. OX IO4Copies/μ 1)，由含有NG目的片段的質(zhì)粒組成，采用TE緩 沖液將上述靈敏度參比品進(jìn)行10倍的梯度稀釋得到下列梯度溶液：Sl為5. OX IO4Copies/ μ 1、S2 為 5. OX IO3Copies/μ 1、S3 為 5. OX IO2Copies/μ 1、S4 為 5. OX IO1Copies/μ 1、S5 為5.0(3〇?丨68/^1、36為5.0\101(：〇?丨68/^1;將31-36作為靈敏度參比品，使用靈敏度 參比品進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)量為5. O copies/μ 1，即10 copies/反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。圖 1明顯表明：該試劑盒的NG靈敏度參比品在1.0 X IO5COpies/ μ 1至1.0 X IOcopies/ μ 1之 間具有很好的線性關(guān)系，同時(shí)該試劑盒的最低檢測(cè)濃度為5. Ocopies/μ 1，即10拷貝/反 應(yīng)。
[0030] 2、特異性實(shí)驗(yàn) 選擇與NG具有相同感染部位的常見(jiàn)病原體作為特異性質(zhì)控品，采用的是滅活的標(biāo)準(zhǔn) 質(zhì)控菌和滅活臨床陽(yáng)性樣本，標(biāo)準(zhǔn)菌采購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC)，八種特異 性質(zhì)控品見(jiàn)表3,對(duì)這八種特異性質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，所有特異性質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果均為陰 性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2表明：大腸埃希菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色 葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、白色念珠菌、糞腸球菌與沙眼衣原體，這八種特異性參考品均 未有典型的"S"型擴(kuò)增曲線，說(shuō)明該試劑盒特異性良好。
[0031] 3、陰性實(shí)驗(yàn) 《核酸擴(kuò)增檢測(cè)測(cè)用試劑盒》規(guī)定：檢測(cè)生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)濃度值的樣本20次，至少17次檢 測(cè)結(jié)果符合要求，同時(shí)對(duì)于陰性要求全部要為陰性。因此制備了 20份無(wú)菌去離子水作為陰 性參比品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明全部為陰性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3說(shuō)明該試劑盒陰性實(shí)驗(yàn)良 好，無(wú)假陽(yáng)性擴(kuò)增。
[0032] 4、精密度實(shí)驗(yàn) 《核酸擴(kuò)增檢測(cè)測(cè)用試劑盒》規(guī)定：用至少高、低2個(gè)濃度水平的樣本各重復(fù)檢測(cè)10次， 計(jì)算Ct值變異系數(shù)（CV，％)，變異系數(shù)（CV，％) = 5%。
[0033] 精密度實(shí)驗(yàn)采用的兩個(gè)梯度質(zhì)粒模板的濃度分別為SO :5. OX IO5Copies/μ 1、S4 : 5. O X lOcopies/μ 1。各重復(fù)10個(gè)樣本，具體采用試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用模板單獨(dú)加 入的方式各加入2 μ 1 ;結(jié)果兩組數(shù)據(jù)的變異系數(shù)均=5%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4說(shuō)明該試 劑盒的精密度滿足《核酸擴(kuò)增檢測(cè)測(cè)用試劑盒》的要求。
[0034] 5、檢測(cè)限實(shí)驗(yàn) 根據(jù)靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該試劑盒可以檢測(cè)到lOcopies/反應(yīng)，因此采用濃度為 5. Ocopies/μ 1的質(zhì)粒參比品S5作為樣本，設(shè)置20個(gè)平行，按照說(shuō)明書(shū)的操作流程進(jìn)行檢 測(cè)，結(jié)果表明20次平行結(jié)果均為陽(yáng)性，因此該試劑盒的檢測(cè)限定為lOcopies/反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié) 果見(jiàn)圖5。圖5說(shuō)明該試劑盒的精密度檢測(cè)限為10拷貝/反應(yīng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種淋病奈瑟菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包含PCR 反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、弱陽(yáng)性質(zhì)控品、裂解液及蛋白酶K溶液；所述PCR反應(yīng)液 中包含了針對(duì)淋病奈瑟氏菌特異序列設(shè)計(jì)的正向引物、反向引物和SYBR Green I染料； 所述正向引物序列為：5'_ ACCGAGCCACCCTCAGACT-3'， 所述反向引物序列為：5'_ GCCCAAATCCCCACCTT-3'， 所述裂解液包含 5. OmM Na0H、10.0 mM Tris-HCl (pH8. 0)、0? 2mM EDTA(pH8. 0)、 l%(V/V)TritonX-100,0. 5% (V/V)NP40,0. 5%(V/V)Tween20 ； 所述陽(yáng)性質(zhì)控品與弱陽(yáng)性質(zhì)控品是含有插入淋病奈瑟氏菌特異性保守序列的PCR2. I 載體質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中增殖后經(jīng)提取純化、用分光光度計(jì)測(cè)定濃 度和純度后用無(wú)菌TE緩沖液定量稀釋；所述陰性質(zhì)控品是滅菌去離子水。2. 如權(quán)利要求1所述的一種淋病奈瑟菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于： 所述PCR反應(yīng)液還包含熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，dATP、dTTP、dGTP、dCTP四種核苷酸。3. 如權(quán)利要求1或2所述的一種淋病奈瑟菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在 于：所述插入淋病奈瑟氏菌特異序列的PCR2. 1載體質(zhì)粒，所插入的特異性序列為： 5'-AACTTACCGCCCTCGTATTGTCCGCACTGCCGTTTGCGGCAGTTGCCGATGTCGGCCTGTACGGCGAAG TCAAAGCTGGTGTGGAAGGCAGGAACATCCGGCTGCAGTTGACCGAGCCACCCTCAGACTGTCAAACGGGCAATACA GTTACTAAGGCCAAAAGCCGCATCAGGACGAAAGTCAGTGATTTCGGCTCGTTTATCGGCTTTAAGTTGGTGGGGAT TTGGGCGGCGGGCTGAAGGCTGTTTGGCAGCTCGAGCAAGACGTATCCGTTGCCGGCGGCGGCGCGACCCGTTGGGG TAACAGGGAATCCTTTATCGGCTTGGCAGGCGAATTCGGCACGGCGCTCGCCGGTCGCGTTGCGAATCCGTTTGGCG ATGCCAGCAAAGCCATTGATCCTTGGGACAGCAATAATAATGTGG-3' 422bp。4. 如權(quán)利要求3所述的一種淋病奈瑟菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于： 所述正向引物序列、反向引物序列還包括其的衍生序列。5. 如權(quán)利要求4所述的一種淋病奈瑟菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于： 所述衍生序列包括引物序列的互補(bǔ)鏈序列，同時(shí)還可以向5'端和3'方向延伸一至數(shù)個(gè)堿 基或刪減一至數(shù)個(gè)堿基得到的序列。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種淋病奈瑟菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含PCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、弱陽(yáng)性質(zhì)控品、裂解液及蛋白酶K溶液；PCR反應(yīng)液中包含了針對(duì)淋病奈瑟氏菌特異序列設(shè)計(jì)的正向引物、反向引物和SYBRGreenI染料；正向引物序列為：5ˊ-ACCGAGCCACCCTCAGACT-3ˊ，反向引物序列為：5ˊ-GCCCAAATCCCCACCTT-3ˊ，上述引物為針對(duì)淋病奈瑟氏菌特異序列設(shè)計(jì)特異性引物，能特異性擴(kuò)增靶DNA序列，可以簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)臨床樣本中淋病奈瑟氏菌感染，具有特異性好、靈敏度高的特點(diǎn)。
【IPC分類】C12Q1/04, C12Q1/68, C12R1/36
【公開(kāi)號(hào)】CN105018571
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410154898
【發(fā)明人】楊金波, 王黎明, 劉志新, 杜宇平, 劉音希
【申請(qǐng)人】蘭州安康伯樂(lè)生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2014年4月17日