第一 cDNA鏈為模板，與引物的基因特異性序列退火后(圖4(d))，進(jìn)行互補(bǔ)鏈延伸反應(yīng)，合成第二 cDNA鏈(圖4(e))。
[0105]然后，將滅菌水495 μ L、1x High Fidelity PCR Buffer (Invitrogen) 100 μ L、2.5mM dNTP mix 100yL、50mM MgS0440 μ L、10 μ M 的 PCR 擴(kuò)增用共有序列引物(Forward) 100 μ L、10 μ M 的 PCR 擴(kuò)增用共有序列引物(Reverse) 100 μ L 以及 Platinum TaqPolymerase High Fidelity (Invitrogen公司)15 μ L混合，將充滿上部反應(yīng)區(qū)域7和下部反應(yīng)區(qū)域8的溶液從出口 306和307排出，立即將上述溶液從入口 305注入。然后，使溶液在94°C保持30秒，重復(fù)40個(gè)循環(huán)的94°C 30秒一55°C 30秒一68°C 30秒的3階段工序，最后在68 °C保持3分鐘后，冷卻至4 °C，從而進(jìn)行PCR擴(kuò)增工序(圖4 (f))。為了實(shí)現(xiàn)這樣的溫度循環(huán)，也可以追加帶加熱器的熱塊(鋁合金或銅合金)309和溫度控制器310。由此，擴(kuò)增了20種靶基因的目的部分，PCR產(chǎn)物大小大體均勻，均為200±8堿基。對(duì)蓄積于溶液中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液進(jìn)行回收。以將該溶液中所含的游離的PCR擴(kuò)增用共有序列引物(Forward/Reverse)、酶等殘留試劑除去為目的，使用PCR Purificat1nKit (QIAGEN公司)進(jìn)行純化。對(duì)該溶液應(yīng)用emPCR擴(kuò)增或橋接擴(kuò)增后，應(yīng)用于各公司(Life Technologies (Solid/1nTorrent)、Illumina (High Seq), Roche 454)的第二代測(cè)序進(jìn)行分析。
[0106]接下來，對(duì)使用了分子識(shí)別標(biāo)簽的擴(kuò)增偏好的降低方法進(jìn)行說明。圖6示意性顯示，獲得分子識(shí)別區(qū)域以外設(shè)為同樣的序列而測(cè)序得到的數(shù)據(jù)的狀態(tài)(示意性圖示獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)的相關(guān)部分)。圖6中顯示下述情況:601、602、603、604、605包括作為隨機(jī)序列的分子識(shí)別標(biāo)簽序列且為同樣的序列，分別獲得了 1、7、4、2、2個(gè)讀數(shù)。這些序列在圖4(e)中合成第二鏈時(shí)均為I分子，在之后的PCR擴(kuò)增中，在分子數(shù)增加的同時(shí)，具有了不同的分子數(shù)。因此，分子識(shí)別標(biāo)簽相同的讀數(shù)可視為同樣的分子，均視為I分子。其結(jié)果是，合成了第二鏈后的工序的PCR擴(kuò)增、在將溶液取出至外部時(shí)因在細(xì)孔陣列片內(nèi)部的吸附導(dǎo)致的各序列分子數(shù)的偏差基于上述同樣的觀點(diǎn)來消除。
[0107]這里，作為獲得的數(shù)據(jù)，1、7、4、2、2是表觀(分子識(shí)別標(biāo)簽以外同樣的序列的)計(jì)數(shù)。細(xì)胞中的分子數(shù)分別計(jì)為I個(gè)計(jì)數(shù)，合計(jì)為5個(gè)計(jì)數(shù)(1、7、4、2、2分別對(duì)應(yīng)于I個(gè)計(jì)數(shù))。即，推測(cè)相當(dāng)于分子標(biāo)簽以外的序列的分子在擴(kuò)增前為5分子。實(shí)際上，數(shù)據(jù)中，分子識(shí)別標(biāo)簽以外的序列不同的讀數(shù)也作為測(cè)序結(jié)果而獲得。此時(shí)，通過對(duì)分子識(shí)別標(biāo)簽不同但其他序列相同的讀數(shù)分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠進(jìn)行對(duì)欲知序列的計(jì)數(shù)。可以推測(cè)為最初的樣品中含有與該計(jì)數(shù)成比例的分子數(shù)的mRNA。
[0108]這里制作的片可以重復(fù)利用，對(duì)于需要知道表達(dá)量的基因群，制作添加有PCR擴(kuò)增用共有序列引物(Reverse)的基因特異性序列引物Mix溶液，與上述同樣地實(shí)施第二cDNA鏈的合成、PCR擴(kuò)增和emPCR，利用第二代測(cè)序進(jìn)行分析即可。S卩，通過重復(fù)利用cDNA文庫，能夠?qū)λ璺N類的基因進(jìn)行高精度的表達(dá)分布測(cè)定。
[0109](實(shí)施例2)
[0110]本實(shí)施例是由配置成陣列狀的細(xì)胞組將各個(gè)細(xì)胞中所含的mRNA在保持了來自哪個(gè)細(xì)胞的信息的狀態(tài)下構(gòu)建cDNA文庫，因此并非是具有使用了珠子的核酸捕獲部的核酸提取器件，而是使用固定有DNA探針的細(xì)孔陣列片作為核酸捕獲部。此外，作為構(gòu)建cDNA文庫后的核酸擴(kuò)增，沒有使用PCR擴(kuò)增，而是使用T7啟動(dòng)子。
[0111]將本實(shí)施例中的核酸提取器件的結(jié)構(gòu)及使用其的提取、處理方法示于圖7、8、9。
[0112]圖7(a)顯示核酸提取器件的單元結(jié)構(gòu)的剖面圖。細(xì)胞I通過使含有細(xì)胞的緩沖液溶液以從上部反應(yīng)區(qū)域7至下部反應(yīng)區(qū)域8貫穿器件的方式流通而被捕捉于細(xì)胞捕獲部
2。細(xì)胞捕獲部2在PDMS制的細(xì)胞陣列器件6中。該細(xì)胞捕捉部的直徑設(shè)為比細(xì)胞的直徑稍大，為16μπι。通過該直徑的設(shè)定，防止了 2個(gè)以上的細(xì)胞被捕捉于該細(xì)胞捕獲部。作為核酸捕獲部的細(xì)孔陣列片71大量形成有貫穿片的細(xì)孔72，DNA探針固定于細(xì)孔72的內(nèi)壁。細(xì)胞捕獲用的PDMS制的細(xì)胞陣列器件6和核酸捕獲用的細(xì)孔陣列片(多孔質(zhì)膜)71是核酸提取器件的基本要素。這兩個(gè)要素直接重疊，這些要素還兼具連接兩者的流路的作用。與實(shí)施例1同樣地，細(xì)胞捕獲后，將含有細(xì)胞的緩沖液置換為L(zhǎng)ysis緩沖液，一邊在與器件垂直的方向上施加電場(chǎng)，一邊使細(xì)胞破碎。由此，破碎的細(xì)胞中的mRNA通過與細(xì)胞捕獲位置的正下方的細(xì)孔72內(nèi)壁上的DNA探針73雜交而被捕捉。
[0113]固定于細(xì)胞陣列片內(nèi)部的DNA探針73從5’末端方向開始，由T7啟動(dòng)子序列、emPCR擴(kuò)增用共有序列(Forward方向)、細(xì)胞識(shí)別用標(biāo)簽序列、分子識(shí)別用標(biāo)簽序列、以及寡聚(dT)序列構(gòu)成。通過將T7啟動(dòng)子序列導(dǎo)入到DNA探針中，能夠通過后續(xù)的利用IVT(InVitro Transcript1n)進(jìn)行的cRNA83擴(kuò)增工序(圖8(e))來進(jìn)行革E標(biāo)序列的擴(kuò)增。
[0114]如后所述，在核酸擴(kuò)增工序中，當(dāng)進(jìn)行利用轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行的從cDNA到cRNA的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選DNA探針進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子序列。作為那樣的啟動(dòng)子序列，除了使用T7以外，還可以列舉SP6、T3等。核酸的擴(kuò)增利用了 T7RNA聚合酶的活性。
[0115]本實(shí)施例中，使用T7啟動(dòng)子序列，該序列由T7RNA聚合酶識(shí)別，從其下游序列開始轉(zhuǎn)錄(CRNA83擴(kuò)增)反應(yīng)。
[0116]由于使用了轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子序列的核酸擴(kuò)增是等溫?cái)U(kuò)增，因此不僅不需要用于施加溫度循環(huán)的溫度控制器，還能夠降低在高溫時(shí)固定于器件表面的探針DNA發(fā)生脫離的可能性。
[0117]通過同樣地導(dǎo)入PCR擴(kuò)增用共有序列，從而可以在后續(xù)的emPCR擴(kuò)增工序中作為公共引物進(jìn)行利用。此外，通過將細(xì)胞識(shí)別標(biāo)簽導(dǎo)入到(例如5個(gè)堿基)DNA探針中，能夠識(shí)別45= 10 24個(gè)單細(xì)胞，這與實(shí)施例1是同樣的。進(jìn)而，通過將分子識(shí)別用標(biāo)簽序列(例如7個(gè)堿基)導(dǎo)入到DNA探針中，能夠識(shí)別47= 1.6x10 4個(gè)分子，因此，能夠?qū)玫诙鷾y(cè)序獲得的龐大的解析數(shù)據(jù)來自何種分子進(jìn)行識(shí)別，這也與實(shí)施例1同樣。即，能夠?qū)VT/emPCR等擴(kuò)增工序中產(chǎn)生的基因間的擴(kuò)增偏好進(jìn)行校正，因此，能夠高精度地對(duì)試樣中初始存在的mRNA量進(jìn)行定量。位于最3’側(cè)的寡聚(dT)序列與添加于mRNA的3’側(cè)的多聚A末尾雜交，用于捕捉mRNA (圖7(a))。
[0118]接下來，對(duì)構(gòu)成核酸捕獲部的細(xì)孔陣列片的制作方法進(jìn)行記述。
[0119]作為細(xì)孔陣列片，可獲得通過陽極氧化法制作的市售品，這里，對(duì)使用孔徑200nm、厚度為60 μ m、13mm見方(從直徑25mm的片切下并利用)的細(xì)孔陣列片71的例子進(jìn)行說明。形成于細(xì)孔陣列片71中的細(xì)孔72貫穿細(xì)孔陣列片71的厚度方向，細(xì)孔彼此完全獨(dú)立。細(xì)孔72兼具流路5的功能。表面為親水性，蛋白質(zhì)向表面的吸附極少，酶反應(yīng)有效地進(jìn)行。首先，對(duì)細(xì)孔陣列片71的表面進(jìn)行硅烷偶聯(lián)等處理并將DNA探針73固定于細(xì)孔表面。DNA探針73按平均30?10nm2—個(gè)的比例固定于表面，因而I個(gè)孔固定有4?10x10 6個(gè)DNA探針。接下來，為了防止表面吸附，用表面涂層劑對(duì)表面進(jìn)行涂覆。該表面涂覆可與探針固定同時(shí)進(jìn)行。該DNA探針密度是能夠?qū)⑼ㄟ^該空間的mRNA以大體100%的效率捕獲于DNA探針的密度。
[0120]接下來，詳細(xì)地對(duì)向細(xì)孔內(nèi)部的DNA探針固定化方法進(jìn)行說明。細(xì)孔陣列片內(nèi)部的細(xì)孔的表面需要在高密度固定有DNA探針的同時(shí)為不吸附mRNA、PCR擴(kuò)增用引物等核酸以及逆轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶等蛋白質(zhì)的表面。本實(shí)施例中，通過共價(jià)鍵，將用于固定DNA探針的硅烷偶聯(lián)劑和防止吸附的經(jīng)硅烷化的MPC聚合物按適當(dāng)?shù)谋壤瑫r(shí)固定于細(xì)孔表面，實(shí)現(xiàn)DNA的高密度固定和核酸、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定的吸附抑制。實(shí)際上，首先將氧化鋁制的細(xì)孔陣列片在乙醇溶液中浸漬3分鐘后，進(jìn)行5分鐘UV03處理，用超純水洗滌3次。接著，在含有3mg/ml作為平均分子量9700(聚合度40)的硅烷化MPC聚合物的MPCas-MPTMSia2 (MPC: 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿/MPTMS1:3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷)(例如，B1materials 2009，30:4930-4938、和 Lab Chip 2007，7:199-206)和 0.3mg/ml 的硅烷偶聯(lián)劑GTMSi (GTMS1:3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷信越化學(xué))、以及作為酸催化劑的0.02%乙酸的80%乙醇溶液中浸漬2小時(shí)。用乙醇洗滌后，在氮?dú)鈿夥障赂稍铮煤嫦湓?20°C加熱處理30分鐘。接著，為了使DNA固定化，通過與噴墨打印機(jī)同樣的技術(shù)，將含有I μΜ 5’氨基經(jīng)修飾的DNA探針、7.5%甘油和0.15Μ NaCl的0.05Μ硼酸緩沖液(pH8.5)在細(xì)孔陣列片上，在每個(gè)25μπιΧ25μπι的區(qū)域排出含有不同的細(xì)胞識(shí)別用標(biāo)簽序列(1024種)的DNA探針，每種100pL。然后，在加濕室內(nèi)在25°C反應(yīng)2小時(shí)。最后，對(duì)未反應(yīng)的縮水甘油基進(jìn)行封端，為了除去過量的DNA探針，用足夠量的含有1mM Lys,0.01% SDS和0.15M NaCl的硼酸緩沖液(pH 8.5)洗滌5分鐘，除去該洗滌液后，用含有0.01% SDS和0.3M NaCl的30mM檸檬酸鈉緩沖液(2xSSC，pH 7.0)在60°C進(jìn)行洗滌，除去過量的DNA。由此，完成DNA探針的固定和表面處理。
[0121]接下來，依次對(duì)反應(yīng)的各步驟進(jìn)行說明。如圖7(a)所示，與前面的實(shí)施例同樣地，mRNA74通過與作為mRNA3’末端的多聚A序列互補(bǔ)的序列的18個(gè)堿基的多聚T序列被捕捉。接下來，合成第一 cDNA鏈79，構(gòu)建cDNA文庫(圖7(b))。接下來，使對(duì)應(yīng)于欲定量的基因的多個(gè)(?100種)靶基因特異性序列引物80與第一 cDNA鏈79退火(圖8(c))，通過互補(bǔ)鏈延伸反應(yīng)，合成第二 cDNA鏈81 (圖8 (d))。即在多重條件下進(jìn)行第二 cDNA鏈合成。由此，對(duì)于多個(gè)革El基因，合成兩端具有擴(kuò)增用共有序列(Forward/Reverse)、序列中包含細(xì)胞識(shí)別標(biāo)簽、分子識(shí)別標(biāo)簽和基因特異性序列的雙鏈cDNA。此外，本實(shí)施例中，作為一例，20 種(ATP5B、GAPDH、⑶SB、HMBS、HPRTl、RPL4、RPLPl、RPS18、RPL13A、RPS20、ALDOA、B2M、EEF1G、SDHA、TBP、VIM、RPLP0、RPLP2、RPLP27和0AZ1)基因特