1302、1303進行選擇，從而僅測定來自特定熒光體的光。細胞的熒光成像利用物鏡1305、成像透鏡1306、CCD相機1307進行。對它們進行控制、取得圖像數據的控制計算機是1308。
[0134]接下來，對流通系統(tǒng)1201的控制體系進行說明。流通系統(tǒng)的控制計算機是1309，其控制XY平臺1310從而使顯微圖像移動。此時，在控制計算機上，能夠使使用細孔陣列片上的位置坐標、細胞識別標簽的序列數據和XY平臺位置坐標計算出的顯微圖像上的位置坐標對應。該控制計算機1309對下述裝置進行適當的控制:控制細胞的流動池系統(tǒng)的細胞導入的細胞導入控制裝置1311，控制改變細胞的狀態(tài)的分化誘導劑、調節(jié)細胞的應答的試劑、用于使細胞破碎的裂解液、用于樣品處理的試劑的導入的試劑控制裝置1312，控制細胞培養(yǎng)條件、PCR時的溫度循環(huán)的溫度、CO2濃度控制裝置1313，多余的試劑、細胞、培養(yǎng)基更換等所使用的上部試劑排出裝置1314，用于將制備的核酸擴增產物排出的下部試劑排出裝置1315。最終獲得的核酸擴增產物被傳遞至第二代(大規(guī)模)DNA測序系統(tǒng)1205，進行序列分析。此時，設為用于測序的emPCR、橋接擴增在該系統(tǒng)中進行。在控制計算機上驗證過的圖像的位置信息和細胞識別標簽序列信息被輸送至整合信息系統(tǒng)1206，進行由熒光圖像獲得的蛋白量與基因表達量的比對。進而，利用同一系統(tǒng)進行基因表達分析數據的經時變化推測。由此，可以對基因表達網絡的動力學進行測定。
[0135]此外，該熒光顯微鏡不僅用于細胞內的測定，還可以用于對導入到細孔陣列片中的、用抗體捕捉的細胞因子等由細胞分泌的物質進行免疫熒光染色并對其量進行測定。當然，還可以同樣地操作，用于破碎后的基因表達量的分析。
[0136]圖14顯示組合微分干涉顯微鏡來代替熒光顯微鏡的例子。微分干涉顯微圖像不使用熒光試劑，僅對形狀進行測定，是再生醫(yī)學等需要將細胞體輸回體內的情況下對細胞的影響最小的測定方法之一。是能夠對由該圖像獲得的細胞形狀的變化與基因表達的變化之間進行比對的情況下細胞損傷最少、能夠進行詳細的細胞分類的測定系統(tǒng)。
[0137]1401是光源，在這里，是鹵素燈。1402是偏光鏡，1403、1404分別是Wollaston濾光片和Wollaston棱鏡。1405是聚光鏡，1406是物鏡。
[0138]圖15顯不使用CARS顯微鏡作為光學顯微鏡的例子。CARS顯微鏡與拉曼顯微鏡、IR顯微鏡同樣，可獲得對應于激光激發(fā)部分的化學種類的光譜，因此能夠使有關細胞狀態(tài)的信息量比微分干涉顯微鏡更多。而CARS為非線性過程，與拉曼信號相比信號強度強，可以以較弱的激光激發(fā)強度獲得充分的信號，因此具有對細胞的損傷小的優(yōu)點。通過使這樣的CARS圖像與基因表達分析數據相對應，從而能夠進行更為詳細的細胞狀態(tài)的判斷。
[0139]1501是光源，在這里，是脈沖激光(微芯片激光)。利用光束分離器1502將其分為兩束，一束導入至非線性纖維(光子晶體光纖)1503，生成斯托克斯光。另一束光直接用作栗浦光和探針光，利用水浸物鏡1504聚光于樣品(細胞中)，生成反斯托克斯光。利用高通濾光片1505僅使反斯托克斯光透過，通過分光器1506，利用分光器用C⑶相機1507取得相干反斯托克斯拉曼光譜。
[0140](實施例4)
[0141]本實施例顯示，細胞捕獲部并非由與細胞同等程度大小的開口部構成、而是由固定有化學捕捉細胞表面的物質，即與細胞表面的物質化學結合的物質的區(qū)域構成的例子。將針對實施例1(圖1)改變了細胞捕獲部的例子示于圖16。配置了在核酸捕獲(捕捉)中使用的珠子上的一部分區(qū)域固定有與細胞表面結合的抗體等蛋白質的珠子。珠子上的抗體可以附加捕捉特定種類的細胞的功能。例如，被稱為⑶(cluster of differentiat1n)抗體的一組抗體是對應于以白細胞為中心的細胞的膜蛋白的種類的抗體組。將該抗體生物素化并用珠子上的鏈霉親和素固定，使用噴墨打印技術打印在圖16的細胞捕獲部2上，從而能夠捕捉具有特定CD分類的抗原的細胞。當然，毋庸置疑，也可以不直接將CD抗體固定于珠子上，而是通過生物素修飾了的第二抗體固定于珠子上。此外，可以將CD抗體以外的抗體固定于珠子上，也可以將結合于細胞上的受體的分子固定。作為這樣的分子的例子，有纖連蛋白。已知纖連蛋白與細胞上的整聯(lián)蛋白相結合。通過將纖連蛋白固定于珠子上，可以捕捉粘接性的細胞。
[0142]作為與細胞表面的物質化學結合的物質的其他例子，可以列舉細胞外基質，例如膠原、層粘連蛋白、彈性蛋白等。
[0143]接下來，顯示對應于實施例3 (圖2)的器件構成中化學地進行細胞捕捉的例子。這是在核酸提取器件的透明區(qū)域的一部分固定用于捕捉細胞的物質的例子。捕捉用物質可以使用與上述同樣的抗體，也可以使用其他物質。圖17顯示核酸提取器件的構成例。將細胞捕捉用抗體1702固定于細胞捕獲部2。固定方法是利用將生物素化的抗體和鏈霉親和素固定于該區(qū)域。能夠僅捕捉具有對應于抗體的抗原1703的細胞。
[0144]進而，顯示對應于實施例2(圖7)的例子。如圖18所示，在細孔陣列片71上的用于捕捉細胞的區(qū)域1801固定抗體，從而形成了能夠捕捉具有對應于抗體的抗原1802的細胞的細胞捕獲部。為了將抗體固定于特定位置，使用噴墨打印頭對經生物素化的抗體進行打印，每次為數十PL左右。通過實施例3所示的方法，器件整個表面被鏈霉親和素覆蓋，因而僅在特定區(qū)域固定有抗體。
[0145](實施例5)
[0146]實施例1?4中，描述第二鏈形成工序(圖2(d)-(e)和圖8 (c)-(d)所示的工序)和PCR擴增工序(圖2(f)和圖8(e))也在圖5、圖10、圖11或圖12所示那樣的裝置中進行的例子。其中，可如下進行:對于核酸提取器件1901的全部或將核酸提取器件分割為多個器件的器件，將器件如圖19所示插入到樹脂制的管1902(—般使用的0.2mL、l.5mL容量等的管)或96孔、384孔板中，通過使第二鏈合成和PCR擴增所需的試劑1903在該管中混合來進行。通過設為這樣的構成，關于這些工序的條件，不僅使用者能夠自由地對條件進行改變，而且，從第二鏈合成開始在管中進行，從而還能夠將細胞識別標簽、分子識別標簽從與實施例1-4所示的位置相反側的末端插入。
[0147]本說明書中引用的全部刊物、專利和專利申請直接作為參考并入本說明書中。
[0148]產業(yè)可利用性
[0149]根據本發(fā)明，能夠對多個培養(yǎng)細胞、多個免疫細胞、(血中)癌細胞等進行生物體分子的定量、序列確定、分子鑒定，能夠對處于何種狀態(tài)的細胞組以何種程度的數量在生物體中存在進行測定。其還可以進行癌癥等的早期診斷、測定iPS細胞的非均質性。
[0150]符號說明
[0151]1:細胞
[0152]2:細胞捕獲部
[0153]3:流路
[0154]4:核酸捕獲部
[0155]5:流路
[0156]6:平面基板
[0157]7:上部反應區(qū)域
[0158]8:下部反應區(qū)域
【主權項】
1.一種核酸提取器件，其特征在于，具有: 用于固定各個單個細胞的細胞捕獲部， 用于從所述細胞提取核酸的核酸提取液通過所述細胞捕獲部而從上至下流動的流路， 介由所述流路與所述細胞捕獲部相連并配置于所述細胞捕獲部的下方，將提取的核酸固定的核酸捕獲部，以及 將核酸提取后的溶液由所述核酸捕獲部向與所述細胞捕獲部相反側排出的流路， 所述細胞捕獲部、所述兩條流路以及所述核酸捕獲部在上下方向上形成配對，該配對在平面方向上配置有多個。2.根據權利要求1所述的核酸提取器件，其特征在于，所述核酸捕獲部包含固定有用于核酸捕獲的DNA的珠子。3.根據權利要求1所述的核酸提取器件，其特征在于，所述核酸捕獲部包含細孔中固定有用于核酸捕獲的DNA的多孔質膜。4.根據權利要求1?3中任一項所述的核酸提取器件，其特征在于，所述細胞捕獲部固定有與細胞表面的物質化學結合的物質。5.根據權利要求2或3所述的核酸提取器件，其特征在于，所述用于核酸捕獲的DNA的一部分包含用于確定在芯片上的位置的序列。6.根據權利要求2或3所述的核酸提取器件，其特征在于，所述用于核酸捕獲的DNA的一部分包含根據所捕獲的核酸分子的不同而不同的序列。7.根據權利要求6所述的核酸提取器件，其特征在于，具有導入用于對所述核酸捕獲部所捕獲的RNA進行逆轉錄的酶的單元。8.根據權利要求1?7中任一項所述的核酸提取器件，其特征在于，所述細胞捕獲部的正下方由光學透明的材料構成。9.根據權利要求1?8中任一項所述的核酸提取器件，其特征在于，所述細胞捕獲部的正下方設有核酸捕獲部。10.根據權利要求1?8中任一項所述的核酸提取器件，其特征在于，所述細胞捕獲部的正下方以外的區(qū)域設有核酸捕獲部。11.一種核酸處理裝置，其特征在于，具有權利要求1?10中任一項所述的核酸提取器件和導入用于構建CDNA文庫的試劑的單元。12.—種核酸處理裝置，其特征在于，具有權利要求1?10中任一項所述的核酸提取器件以及導入用于構建cDNA文庫的試劑和用于核酸擴增的試劑的單元。13.一種核酸處理裝置，其特征在于，具有權利要求1?10中任一項所述的核酸提取器件，以及用于利用微分干涉顯微鏡、相位差顯微鏡、拉曼顯微鏡或相干拉曼顯微鏡對捕獲于細胞捕獲部的細胞進行觀察的顯微鏡部。14.一種方法，其特征在于，為利用具有細胞捕獲部和配置于所述細胞捕獲部下方的核酸捕獲部的核酸提取器件從細胞提取核酸的方法，包括下述工序: 使細胞與所述細胞捕獲部接觸，從而將各個單個細胞捕獲于所述細胞捕獲部的工序， 使用于從細胞提取核酸的核酸提取液通過所述細胞捕獲部，通過從上至下連通的流路來流動的工序， 將提取的核酸固定于所述核酸捕獲部的工序，以及 使核酸提取后的溶液從所述核酸捕獲部介由流路在與所述細胞捕獲部相反側排出的工序， 所述核酸提取器件中，所述細胞捕獲部、所述兩條流路以及所述核酸捕獲部在上下方向上形成配對，該配對在平面方向上配置有多個。
【專利摘要】為了對多個細胞中的多個基因進行基因表達，需要在分離細胞后提取基因，進行核酸擴增，通過序列分析進行基因表達分析。然而，細胞的分離對細胞造成損傷，需要使用昂貴的系統(tǒng)。將細胞捕獲部和核酸捕獲部的一對結構在上下方向上配置，提取細胞的各個基因，在核酸捕獲部合成cDNA，擴增核酸，通過第二代測序進行序列分析，從而高精度地進行各個細胞中的基因表達分析。
【IPC分類】C12Q1/68, C12M1/00, C12N15/09
【公開號】CN105026562
【申請?zhí)枴緾N201380073998
【發(fā)明人】白井正敬, 神原秀記, 谷口妃代美, 田邊麻衣子
【申請人】株式會社日立制作所
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2013年3月12日
【公告號】WO2014141386A1