為二氯甲烷：甲醇=40 : 1的柱層析條 件提純得到產(chǎn)物。產(chǎn)率：65%。
[0434] 4MMR(400MHz，CDC13)S11. 35(s，1H)，8. 51 (s，1H)，8. 21 (m，1H)，7. 93(m，1H) ,7. 74 (d,J= 1. 2Hz, 1H), 7. 25 (s, 1H), 7. 19 (s, 1H), 6. 93 (m, 1H), 5. 87 (s, 1H), 4. 3 (s, 2H),3. 51 (s, 4H), 3. 05 - 2. 95 (m, 2H), 2. 92 (m, 2H), 2. 62 (m, 2H), 2. 40 (s, 4H), 2. 22 (d,J= 3. 6Hz, 6H), 2. 10 (s, 3H),L96 - 1. 84 (m, 1H), 1. 79 (m, 1H), 1. 69 (m, 4H),L54 (m, 2H), 1. 49(s ，2H)，1. 21 (m, 2H)，0? 81 (t,J= 6. 8Hz, 3H)。MS-ESI(m/s) : 579. 3 (M+l)。
[0435] 實(shí)施例42 1-異丙基-3-甲基-N_((l-甲基-3-氧-2, 3, 5, 6, 7, 8-六氫異喹 啉-4-基）甲基）-6-(4-(嗎啉甲基）苯）-lH-吲哚-4-甲酰胺（化合物G-2)的制備
[0436]
[0437] 以環(huán)己酮為原料，經(jīng)過與合成化合物G-1類似的反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物，產(chǎn)率 71%。
[0438] 4 MMR(400MHz，CDC13)S11. 35(s，1H)，8. 51 (s，1H)，8. 21 (m，1H)，7. 93(m，1H) ,7. 74 (d,J = 1. 2Hz, 1H), 7. 25 (s, 1H), 7. 19 (s, 1H), 6. 93 (m, 1H), 5. 87 (s, 1H), 4. 3 (s, 2H ),3. 51 (s, 4H), 3. 05 - 2. 95 (m, 2H), 2. 92 (m, 2H), 2. 62 (m, 2H), 2. 40 (s, 4H), 2. 22 (d,J= 3. 6Hz, 6H), 2. 10 (s, 3H),L96 - 1. 84 (m, 1H), 1. 79 (m, 1H), 1. 69 (m, 4H),L54 (m, 2H), 1. 49(s ，2H), 1. 36(s, 2H), 1. 21(m, 2H), 0? 81(t,J= 6. 8Hz, 3H)。MS(ESI)m/z:593. 2。
[0439] 實(shí)施例43 1-異丙基-3-甲基-N_( (1,7-二甲基-3-氧-2, 3, 5, 6, 7, 8-六氫異喹 啉-4-基）甲基）-6-(4-(嗎啉甲基）苯）-lH-吲哚-4-甲酰胺（化合物G-3)的制備
[0440]
[0441] 以4-甲基環(huán)己酮為原料，經(jīng)過與合成化合物G-1類似的反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物，產(chǎn) 率 64%。
[0442] 4MMR(400MHz，CDC13)S11. 35(s，1H)，8. 51 (s，1H)，8. 21 (m，1H)，7. 93(m，1H) ,7. 74 (d,J = 1. 2Hz, 1H), 7. 25 (s, 1H), 7. 19 (s, 1H), 6. 93 (m, 1H), 5. 87 (s, 1H), 4. 3 (s, 2H ),3. 51 (s, 4H), 3. 05 - 2. 95 (m, 2H), 2. 92 (m, 2H), 2. 62 (m, 2H), 2. 40 (s, 4H), 2. 22 (d,J= 3. 6Hz，6H)，2. 10 (s，3H)，1. 96 - 1. 84 (m，1H)，1. 79 (m，1H)，1. 69 (m，4H)，1. 49 (s，2H)，1. 36(s，2H), 1. 21(m，2H)，1. 01(d，J= 6. 4Hz，3H)，0? 81(t，J= 6. 8Hz，3H)。MS(ESI)m/z:607. 2。
[0443] 實(shí)施例44 1-環(huán)戊4-((1-甲基-3-氧-3,5,6,7-四氫-211-環(huán)戊[(3]吡啶-4-基） 甲基）-6-(4-(嗎啉甲基）苯）-lH-吲哚-4-甲酰胺（化合物H-l)的制備
[0444]
[0447] 往6-溴-1H-吲哚-4-甲酸甲酯（1. 0g，3. 94mmol)固體在N，N-二甲基甲酰胺 (25mL)中的冷卻的0°C)溶液中加入氫化鈉（0? 173g，4. 33mmol)。攪拌反應(yīng)15分鐘，此時(shí) 加入溴代環(huán)戊烷（〇. 554mL，5. 90mmol)。然后將反應(yīng)加溫至室溫（RT)并維持過夜。將反應(yīng) 容器放回至冰浴中并攪拌15分鐘。然后加入過量NaH(60% )并攪拌10分鐘，再加入2-嗅 丙烷（過量）。移除冰浴并將反應(yīng)攪拌1小時(shí)。在真空中除去約一半的反應(yīng)容積并傾倒至 飽和氯化銨溶液（200mL)中。用乙醚（2x)萃取并用鹽水清洗合并的有機(jī)物，干燥（MgS04) 并濃縮。采用流動(dòng)相為二氯甲烷：甲醇=40 : 1的柱層析條件提純得到產(chǎn)物。
[0448]步驟 2
[0449]
[0450] 飽和氫氧化鈉（0. 68g，17. 2mmol)水溶液加入到上步產(chǎn)物（3. 23g，11. 45mmol)的 乙醇溶液中，60°C攪拌1小時(shí)。當(dāng)反應(yīng)完成后，減壓濃縮反應(yīng)液，加入IN鹽酸調(diào)節(jié)pH至沒 有新固體析出，將析出物抽濾干燥，得到產(chǎn)物。
[0451]步驟 3
[0452]
[0453] 在二甲亞砜溶液中，將上步產(chǎn)物（309mg，lmmol)與適量的4-氨甲基-1-甲 基-6, 7-二氫-2H-環(huán)戊酮[c]吡啶-3 (5H)-酮鹽酸鹽混合，隨后加入HOAT(272mg，2mmol) 和EDCI(382mg，2mmol)，室溫?cái)嚢柽^夜，加水，抽濾得濾餅，通過柱層析得到產(chǎn)品。
[0454] 步驟 4
[0455]
[0456] 將上步產(chǎn)物（455mg，1.Ommol)，4_(4_
嗎啉甲基）苯硼酸頻哪酯（330mg，1.lmmol)， [1，1'-雙（二苯基膦）二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物（40mg，0.05mmol)加入到圓底燒 瓶中，隨后加入5mL二氧六環(huán)和lmL3. 6N的碳酸鈉水溶液，氮?dú)庵脫Q三次，100°C加熱4小 時(shí)，加水，乙酸乙酯萃取，有機(jī)層合并后采用流動(dòng)相為二氯甲烷：甲醇=40 : 1的柱層析 條件提純得到產(chǎn)物。產(chǎn)率78%。
[0457] 4MlR(400MHz，CDC13)S11. 35(s，1H)，8. 51 (s，1H)，8. 21 (m，1H)，7. 93(m，1H ),7. 74 (d,J= 1. 2Hz, 1H),7. 25 (s, 1H),7. 19 (s, 1H),6. 93 (m, 1H),5. 87 (s, 1H),4. 3 (s, 2H),3. 51 (s, 4H),3. 05 - 2. 95 (m, 2H),2. 92 (m, 2H),2. 62 (m, 2H),2. 40 (s, 4H),2. 22 (d,J =3. 6Hz, 6H),1. 96 - 1. 84 (m, 1H),1. 69 (m, 2H),1. 49 (s, 2H),1. 21 (m, 2H),1. 01 (d,J= 6. 4Hz, 3H)，0? 81 (t,J= 6. 8Hz, 3H)。MS-ESI(m/s) : 565. 3 (M+l)。
[0458] 實(shí)施例45 1-環(huán)戊-N_((l-甲基-3-氧，2,3,6,7,8_六氫異喹啉-4-基）甲 基）-6-(4-(嗎啉甲基）苯基）-lH-吲哚-4-甲酰胺（化合物H-2)的制備
[0459]
[0460] 以環(huán)己酮為原料，經(jīng)過與合成化合物H-1類似的反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物，產(chǎn)率 74%〇
[0461] 4MMR(400MHz，CDC13)S11. 35(s，1H)，8. 51 (s，1H)，8. 21 (m，1H)，7. 93(m，1H) ,7. 74 (d,J= 1. 2Hz, 1H), 7. 25 (s, 1H), 7. 19 (s, 1H), 6. 93 (m, 1H), 5. 87 (s, 1H), 4. 3 (s, 2H),3. 51 (s, 4H),3. 05 - 2. 95 (m, 2H),2. 92 (m, 2H),2. 62 (m, 2H),2. 40 (s, 4H),2. 22 (d,J= 3. 6Hz，6H)，1. 96 - 1. 84 (m，1H)，1. 69 (m，2H)，1. 49 (s，2H)，1. 36 (s，2H)，1. 21 (m，2H)，1. 01(d ，J= 6.4Hz，3H)，0.81(t，J= 6.8Hz，3H)。MS(ESI)m/z:579.2。
[0462] 實(shí)施例46 1-環(huán)戊-N_((l，7-二甲基-3-氧，2,3,6,7,8_六氫異喹啉-4-基）甲 基）-6-(4-(嗎啉甲基）苯基）-lH-吲哚-4-甲酰胺（化合物H-3)的制備
[0463]
[0464] 以4-甲基環(huán)己酮為原料，經(jīng)過與合成化合物H-1類似的反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物，產(chǎn) 率 76%〇
[0465] 4MMR(400MHz，CDC13)S11. 35(s，1H)，8. 51 (s，1H)，8. 21 (m，1H)，7. 93(m，1H) ,7. 74 (d,J= 1. 2Hz, 1H),7. 25 (s, 1H),7. 19 (s, 1H),6. 93 (m, 1H),5. 87 (s, 1H),4. 3 (s, 2H),3. 51 (s, 4H),3. 05 - 2. 95 (m, 2H),2. 92 (m, 2H),2. 62 (m, 2H),2. 40 (s, 4H),2. 22 (d,J= 3. 6Hz, 6H),L96 - 1. 84 (m, 1H), 1. 79 (m, 1H), 1. 69 (m, 4H), 1. 49 (s, 2H),L36 (s, 2H),L21(m ，2H), 1. 01(d,J= 6. 4Hz, 3H), 0? 81(t,J= 6. 8Hz, 3H)。MS(ESI)m/z:593. 2。
[0466] 實(shí)施例47本發(fā)明包含的化合物對EZH2酶抑制活性檢測
[0467] EZH2 酶（WT，Y641F和A677G)購自Biogenie公司，化合物GSK-126 和EPZ6438 購自 Xcessbi公司，SAM購自Sigma公司（Cat.No. 7007)，384孔檢測板和磁珠購自PerkinElmer 公司。
[0468] 采用AlphaLISA篩選方法對化合物進(jìn)行EZH2 (Y641F)酶活性檢測。將化合物儲(chǔ)備 液（10mM)用DMS0稀釋到不同濃度，采用三倍稀釋法。分別取100uL的體積加入到384孔 檢測板中，最高濃度為500nM，最低濃度為0. 7nM，每個(gè)藥物濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別加入 5uL的EZH2酶溶液，1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，室溫孵育15分鐘。加入5uL修飾后的底物， 1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，室溫孵育1小時(shí)。加入5uL受體磁珠終止酶反應(yīng)，1000轉(zhuǎn)/分離 心1分鐘，室溫孵育1小時(shí)。避光條件下加入10uL供體磁珠，1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，室溫 孵育30分鐘，采用EnSpire的Alpha模式檢測信號強(qiáng)度。計(jì)算化合物對EZH2酶活性的半 數(shù)抑制濃度（IC5。），結(jié)果見表1。其中，EPZ6438和GSK126是目前文獻(xiàn)已報(bào)道的EZH2小分 子抑制劑，EPZ6438的中文名稱N-((4,6-二甲基-2-氧-1,2-二氫-3-基）甲基）-5-(乙 基（四氫-2H-呋喃-4-基）氨基）-4_甲基-4'-(嗎啉甲基）聯(lián)苯-3-甲酰胺，結(jié)構(gòu)式
GSK126的中文名稱1-異丁基-N-((4,6-二甲基-2-氧-1，2-二氫吡 啶-3-基）-3-甲基-6-(6-(哌嗪-1-基）吡啶-3-基）-lH-吲哚-3-甲酰胺，結(jié)構(gòu)式為
[0469] 表1化合物的EZH2 (WT，Y641F和A677G)酶活性
[0470]
[0471]

[0472] 表1中的"NT"表示沒有進(jìn)行相應(yīng)測試。
[0473] 從表1可以看出，大部分化合物表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的EZH2酶抑制活性，活性維持在亞 納摩爾到低納摩爾水平。
[0474] 實(shí)施例48本發(fā)明化合物抑制腫瘤細(xì)胞株增殖的實(shí)驗(yàn)
[0475] 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL6和HBL-1，肺癌細(xì)胞株H460和H1975均購 自于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC)，RPMI1640培 養(yǎng)基，胎牛血清（FBS)均購買自美國GIBICO公司；青霉素和鏈霉素購自大連寶生物公司； 培養(yǎng)細(xì)胞用平皿和96孔板等購買于Corning公司；各種規(guī)格的離心管購自BD公司；CCK-8 試劑購自日本同仁化學(xué)研究所（Donjindo) 〇
[0476] 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株（SU-DHL6)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株（HBL-1) 肺癌細(xì)胞株（H460)和肺癌細(xì)胞株（H1975)均用含10%胎牛血清（FBS)、100IU/ml青霉素、 100yg/ml鏈霉素的常規(guī)高糖RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0477] 為了檢測新化合物對SU-DHL6、HBL-1、H460和H1975細(xì)胞的增殖影響。收集處于 對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1000~2000個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，按照每孔100uL接 種于96孔板中。將化合物儲(chǔ)備液（10mM/L溶于DMS0)用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，采用三倍 稀釋法。按每孔100uL的體積加入96孔板中，最高濃度為30uM，最低濃度為0.luM，每個(gè)藥 物濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并用含0. 1 %DMS0培養(yǎng)基和純培養(yǎng)基處理細(xì)胞作為陰性對照，置細(xì)胞 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞SU-DHL6、HBL-1細(xì)胞培養(yǎng)10天，肺癌細(xì)胞 株H460和H1975細(xì)胞培養(yǎng)6天。采用CCK-8檢測細(xì)胞線粒體脫氫酶活性，并計(jì)算新化合物 對腫瘤細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度（IC50)值（表2)。
[0478] 表2化合物對腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制作用（CCK-8法）
[0479]
[0480] 注：N/D表示沒有進(jìn)行相應(yīng)測試。
[0481] 從表2可以看出，受試化合物對淋巴瘤細(xì)胞株和肺癌細(xì)胞株都顯示出了較強(qiáng)的增 殖抑制活性，達(dá)到低微摩爾水平。
[0482] 實(shí)施例49本發(fā)明化合物抑制彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株增殖的實(shí)驗(yàn)
[0483] 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL6、Pffeifer和HBL-1均購自于美國標(biāo)準(zhǔn)生 物品收藏中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC)，RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清 (FBS)均購買自美國GIBIC0公司；青霉素和鏈霉素購自大連寶生物公司；培養(yǎng)細(xì)胞用平皿 和96孔板等購買于Corning公司；各種規(guī)格的離心管購自BD公司；MTT試劑購自日本同仁 化學(xué)研究所（Donjindo)。
[0484] 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株（SU-DHL6)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株（HBL-1) 和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株（Pffeifer)均用含10%胎牛血清（FBS)、100IU/mL青霉 素、100yg/ml鏈霉素的常規(guī)高糖RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)。
[0485] 為了檢測新化合物對SU-DHL6、Pffeifer和HBL-1細(xì)胞的增殖影響。收集處于對 數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1000~2000個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，按照每孔100uL接種 于96孔板中。將化合物儲(chǔ)備液（10mM/L溶于DMS0)用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，采用三倍稀 釋法。按每孔lOOuL的體積加入96孔板中，最高濃度為30uM，最低濃度為0.luM，每個(gè)藥物 濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并用含0. 1 %DMS0培養(yǎng)基和純培養(yǎng)基處理細(xì)胞作為陰性對照，置細(xì)胞培 養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4天，采用MTT檢測細(xì)胞線粒體脫氫酶活性，并計(jì)算新化合物對腫瘤細(xì)胞 的半數(shù)有效抑制濃度（IC5。）值（表3)。
[0486] 表3化合物對三種淋巴瘤細(xì)胞株的增殖作用（MTT法）
[0487]
[0488] 從表3中可以看出，受試化合物對三種淋巴瘤細(xì)胞株顯示出強(qiáng)烈的增殖抑制活 性，IC5。值達(dá)到低微摩爾水平。
[0489] 實(shí)施例50本發(fā)明化合物A-2抑制人原代腫瘤干細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)
[0490] 人源結(jié)直腸癌和胃癌原代細(xì)胞來自于四川大學(xué)華西醫(yī)院胃腸外科手術(shù)切除樣本， 采用無血清培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲得。DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS)均購買自美國GIBIC0公 司；細(xì)胞消化液accutase購自Promocell公司；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF)，表皮生 長因子（EGF)，B27購自于BD公司；青霉素和鏈霉素購自大連寶生物公司；培養(yǎng)細(xì)胞采用的 超低吸附平皿和96孔板等購買于Corning公司；各種規(guī)格的離心管購自BD公司；CCK-8試 劑購自日本同仁化學(xué)研究所（Donjindo) 〇
[0491] 結(jié)直腸癌和胃癌干細(xì)胞采用含2%B27, 20ug/LbFGF、20ug/LEGF的DMEM/F12培 養(yǎng)基培養(yǎng)于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0492] 為了檢測新化合物對胃癌和結(jié)直腸癌干細(xì)胞的增值影響。收集處于對數(shù)生長期的 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5000~8000個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，按照每孔100uL接種于96孔板 中，待細(xì)胞恢復(fù)兩天后，將化合物儲(chǔ)備液（10mM/L溶于DMS0)用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，采 用三倍稀釋法。按每孔l〇〇uL的體積加入96孔板中，最高濃度為30uM，最低濃度為0.luM， 每個(gè)藥物濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并用含0. 1 %DMS0培養(yǎng)基和純培養(yǎng)基處理細(xì)胞作為陰性對 照，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4天，采用CCK-8 (2-(2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-(4-硝基苯 基）-5- (2, 4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）檢測細(xì)胞線粒體脫氫酶活性，按照CCK-8試劑盒 說明書每孔內(nèi)加入20ULCCK-8溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2~4h后，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于 450nm吸收波長測定各孔吸光度值（opticaldensity，0D)并記錄結(jié)果后計(jì)算各藥物濃度 的0D450。按下列公式計(jì)算藥物對細(xì)胞的生長抑制率：細(xì)胞生長增殖抑制率（％ ) = 1-(實(shí) 驗(yàn)組0D450值/對照組0D450)X100%。最后，用生物統(tǒng)計(jì)軟件GraphpadPrism計(jì)算擬合 藥物的生長抑制曲線并計(jì)算新化合物的半數(shù)有效抑制濃度（IC5。）值（表4、圖1)。
[0493] 表4化合物A-2對人原代腫瘤干細(xì)胞的增殖抑制作用
[0494]
[0495] 化合物A-2對人原代腫瘤干細(xì)胞增殖的檢測，結(jié)果顯示本發(fā)明制備的化合物A-2 對腫瘤干細(xì)胞有一定的增殖抑制作用。
[0496] 實(shí)施例51本發(fā)明化合物的溶解度實(shí)驗(yàn)
[0497] 本研究中，為測定化合物的溶解度，先將藥物加入到不同的溶劑中，超聲30min 后，水浴37°C恒溫振蕩24小時(shí)，形成藥物的飽和溶液，然后再稀釋合適的倍數(shù)，離心后取上 清液，采用高效液相法測定在不同溶劑中的溶解度。
[0498] 表5本發(fā)明化合物的溶解度
[0499]
[0500] 相對于已報(bào)道的EZH2抑制劑EPZ6438,化合物A-2、A-25、A-29在水中或者有機(jī)溶 劑中溶解度均顯著提高，幾十倍甚至上百倍的提高。
[0501] 實(shí)施例52化合物A-25對pfeiffer和SU-DHL-6兩種淋巴腫瘤細(xì)胞株的H3K27me3 表達(dá)量的影響
[0502] 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL-6和Pfeiffer均購自于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收 藏中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC)，RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS)均 購買自美國GIBIC0公司；青霉素和鏈霉素購自大連寶生物公司；培養(yǎng)細(xì)胞用平皿和96孔 板等購買于Corning公司；各種規(guī)格的離心管購自BD公司；抗體包括anti-H3K27me3，anti _H3K27me2,anti_EZH2,anti_H3andanti-0-actin選自美國CellSignalingTechnology 公司；相應(yīng)的二抗選自中國的中杉金橋公司。
[0503] 在37°C下，細(xì)胞用不同濃度的化合物處理一定時(shí)間后，細(xì)胞收集，用冰PBS洗滌， 用RIPA緩沖液（Beyotime，中國）溶解。然后測定蛋白濃度，并用5 - 10%SDS-PAGE分離 蛋白，用特定的抗體標(biāo)記后，并用相應(yīng)的二抗繼續(xù)孵育得到檢測結(jié)果。
[0504] 從圖2可以看出，A-25可以顯著減少細(xì)胞整體的H3K27me3(組蛋白H3第27位上 賴氨酸的三甲基化）的水平，且呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴型。
[0505] 實(shí)施例53化合物A-29對MCF-7和MDA-MB-231兩種乳腺腫瘤細(xì)胞株的H3K27me3 表達(dá)量的影響
[0506] 乳腺瘤細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231均購自于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（American TypeCultureCollection，ATCC)，RPMI1640 培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS)均購買自美國 GIBIC0公司；青霉素和鏈霉素購自大連寶生物公司；培養(yǎng)細(xì)胞用平皿和96孔板等購買于 Corning公司；各種規(guī)格的離心管購自BD公司；抗體包括anti-H3K27me3，anti-H3K27me2, anti-EZH2,anti-H3andanti-0-actin選自美國CellSignalingTechnology公司；相 應(yīng)的二抗選自中國的中杉金橋公司。
[0507] 在37°C下，細(xì)胞用不同濃度的化合物處理一定時(shí)間后，細(xì)胞收集，用冰PBS洗滌， 用RIPA緩沖液（Beyotime，中國）溶解。然后測定蛋白濃度，并用5 - 10%SDS-PAGE分離 蛋白，用特定的抗體標(biāo)記后，并用相應(yīng)的二抗繼續(xù)孵育得到檢測結(jié)果。
[0508] 從圖3可以看出，A-29可以顯著減少細(xì)胞整體的H3K27me3(組蛋白H3第27位上 賴氨酸的三甲基化）的水平，且呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴型。
[0509] 實(shí)施例54化合物A-25對SU-DHL-6的細(xì)胞周期的影響
[0510] 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL-6購自于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心 (AmericanTypeCultureCollection，ATCC)，RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS)均購買自 美國GIBIC0公司；青霉素和鏈霉素購自大連寶生物公司；培養(yǎng)細(xì)胞用平皿和96孔板等購 買于Corning公司；各種規(guī)格的離心管購自BD公司；其余PI等試劑購自Sigma公司（USA)。
[0511] 通過流式細(xì)胞術(shù)研究化合物對細(xì)胞周期的影響：收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸浮 濃度，以每孔2~10X105個(gè)細(xì)胞接種到6孔板，每孔體積2mL;置37°C、5% 0)2溫箱培養(yǎng) 24小時(shí)后；小心吸去上清，按濃度梯度每孔加入已配好的含藥培養(yǎng)液2mL，并設(shè)置不加藥物 的對照組。置37°C、5%C02溫箱培養(yǎng)48小時(shí)。然后按照以下方法處理細(xì)胞：（1)收集每個(gè) 孔中的細(xì)胞，按濃度依次編號裝入流式管，4°C，2000r/min離心3分鐘，棄去上清液；(2)用 3mLPBS重懸細(xì)胞，相同方法離心，棄去PBS;(3)用75%的乙醇固定細(xì)胞30min，相同方法 離心，棄去上清液；（4)再用3mLPBS重懸細(xì)胞，相同方法離心，棄去PBS; (5)加入含Triton X-100的PI染液lmL，混勻，室溫避光20分鐘；流式細(xì)胞儀檢測。
[0512]從圖3可以看出，SU-DHL-6細(xì)胞分別用0? 625yM, 1. 25yM, 2. 5yM, 5yMor 10yM的化合物A-25處理14天，然后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化。A-25可以顯 著阻滯化合物的細(xì)胞G1期，相應(yīng)的減少S期，同時(shí)對G2/M期沒有影響，且造成的影響呈現(xiàn) 劑量依賴型。
[0513] 實(shí)施例55化合物對兩種腫瘤細(xì)胞株及三種正常細(xì)胞株的MTT測試
[0514] 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL-6和Pfeiffer，正常細(xì)胞株HEK-293,L02 和VER0均購自于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC)， RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS)均購買自美國GIBICO公司；青霉素和鏈霉素購自大連 寶生物公司；培養(yǎng)細(xì)胞用平皿和96孔板等購買于Corning公司；各種規(guī)格的離心管購自BD 公司；MTT試劑購自日本同仁化學(xué)研究所（Donjindo)。
[0515] 用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1-2X104/mL，接種于96孔板，每孔200yL，培養(yǎng)過 夜，次日分別用梯度濃度的目標(biāo)化合物處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不含藥物的陰性對照組和等體積 的溶劑對照組，DMS0濃度為0. 1 %，每個(gè)劑量組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37°C，5 %C02培養(yǎng)。培養(yǎng)6天 后，每孔加入5mg/mLMTT試劑20yL，振蕩混勾15min，用酶標(biāo)儀（A= 570nm)測定吸光度 (A)值（A值與活細(xì)胞數(shù)成正比），取其平均值。
[0516] 相對細(xì)胞增殖抑制率（％ )=(對照組A570-實(shí)驗(yàn)組A570)/對照組A 570X100%o
[0517] 表6化合物對兩種腫瘤細(xì)胞株及三種正常細(xì)胞株的IC5。
[0518]
[0519] 從表6可以看出，本發(fā)明化合物在作用時(shí)間達(dá)到6天時(shí)，對腫瘤細(xì)胞株有較好的抑 制作用，達(dá)到低微摩爾級別，而對正常細(xì)胞株沒有毒性作用（大于40微摩爾），說明了化合 物具有一定的體外安全性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.吡啶酮衍生物，其特征在于：結(jié)構(gòu)式如式I所示：其中，X為O或S; &、R5、R6、馬獨(dú)立的為H或Cl~C4烷基； 當(dāng)私為H或Cl~C8烷基時(shí)，R3和R4組合形成的環(huán)為取代或未取代的C3~C8環(huán)烷 基、取代或未取代的C5~ClO的橋環(huán)烷基、取代或未取代的C5~ClO的稠環(huán)烷基、取代或 未取代的C3~C8環(huán)烯基、取代或未取代的3~8元飽和雜環(huán)烷基、取代或未取代的3~8 元不飽和雜環(huán)烷基、取代或未取代的5~10元橋環(huán)雜環(huán)烷基、取代或未取代的C3~C8環(huán) 酮基、取代或未取代的3~8元飽和雜環(huán)酮基、取代或未取代的3~8元不飽和雜環(huán)酮基、 取代或未取代的5~10元螺環(huán)雜環(huán)烷基、取代或未取代的C6~C14芳基或C3~C8環(huán)烷 基稠合C6~C14芳基； 所述取代的C3~C8環(huán)烷基、C5~ClO的橋環(huán)烷基、C5~ClO的稠環(huán)烷基、C3~C8環(huán) 烯基、3~8元飽和雜環(huán)烷基、3~8元不飽和雜環(huán)烷基、C5~ClO橋環(huán)雜環(huán)烷基、C3~C8 環(huán)酮基、3~8元飽和雜環(huán)酮基、3~8元不飽和雜環(huán)酮基、5~10元螺環(huán)雜環(huán)烷基或C6~ C14芳基的取代基為-H、鹵素、Cl~C4烷基、鹵素取代的Cl~C4烷基、Cl~C4烷基取代 的氧羰基或Cl~C4烷基取代的羰氧基； 所述的3~8元飽和雜環(huán)烷基、3~8元不飽和雜環(huán)烷基、5~10元橋環(huán)雜環(huán)烷基、3~ 8元飽和雜環(huán)酮基、3~8元不飽和雜環(huán)酮基或5~10元螺環(huán)雜環(huán)烷基中的雜原子為N、O 或S，雜原子個(gè)數(shù)為1~3個(gè)； 或當(dāng)&為-H、Cl~C4烷基或鹵素取代的Cl~C4烷基時(shí)，RjPR3組合形成的環(huán)為 取代或未取代的C3~C8環(huán)烷基、取代或未取代的C5~ClO的橋環(huán)烷基、取代或未取代的 C5~ClO的稠環(huán)烷基、取代或未取代的C3~C8環(huán)烯基、取代或未取代的3~8元飽和雜環(huán) 烷基、取代或未取代的3~8元不飽和雜