突變型Taq DNA聚合酶及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種突變型TaqDNA聚合酶及其制備方法 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] TaqDNA聚合酶是一種耐熱的DNA聚合酶，由水生棲熱菌中分離得到的。1969年在 美國(guó)黃石國(guó)家森林公園火山溫泉中分離得到一種水生棲熱菌（Thermusaquaticus)YT_l， 它能生長(zhǎng)在70°C~75°C極富含礦物質(zhì)的環(huán)境中。1976年，A.Chien從水生棲熱菌中分離 純化得到了耐熱的TaqDNA聚合酶。1983年karyMullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)， 1988年RandalIK.Saiki等也從水生棲熱菌中分離純化得到TaqDNA聚合酶并將它應(yīng)用于 PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了PCR過(guò)程自動(dòng)連續(xù)循環(huán)?，F(xiàn)有的研究表明，TaqDNA聚合酶屬于DNA聚合 酶I家族，酶基因全長(zhǎng)2496個(gè)堿基，編碼832個(gè)氨基酸，分子量為94kD。TaqDNA聚合酶在 70°C~75°C時(shí)具有最高的生物學(xué)活性，在92. 5°C酶活性可持續(xù)130min，95°C持續(xù)40min， 97. 5°C持續(xù)5min~6min可保持約50%的酶活性。
[0003] 在PCR反應(yīng)中使用TaqDNA聚合酶，由于TaqDNA聚合酶在高溫下能保持一定的 活性，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷，大大降低了成本。然而，隨著PCR技 術(shù)的日益推廣和應(yīng)用，研究人員對(duì)TaqDNA聚合酶性能要求不斷提高。野生型TaqDNA聚 合酶結(jié)構(gòu)上的缺陷，使其在許多應(yīng)用領(lǐng)域受到限制。現(xiàn)有的TaqDNA聚合酶活性低、耐受性 低，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)及科研應(yīng)用的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，有必要提供一種酶活性高、耐受性高的突變型TaqDNA聚合酶，以及其制 備方法和應(yīng)用。
[0005] 一種突變型TaqDNA聚合酶，包括：
[0006](a)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸編碼得到的多肽；
[0007] (b)、與SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98%同源性的多 核苷酸編碼得到的多肽；或
[0008] (c)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，其中一個(gè)或多個(gè)堿基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0009] 一種突變型TaqDNA聚合酶，包括：
[0010] (a)、由SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽；
[0011] (b)、與SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98%同源性的多肽； 或
[0012] (c)、由SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺 失、替代或增加得到的多肽。
[0013] -種突變型TaqDNA聚合酶的制備方法，包括如下步驟：
[0014] 步驟一、提供用于表達(dá)突變型TaqDNA聚合酶的基因表達(dá)序列，所述突變型Taq DNA聚合酶包括：（a)、由SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)、與SEQIDNo. 2 所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98%同源性的多肽；或（c)、由SEQIDNo.2所示的 氨基酸序列組成的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽；
[0015] 步驟二、將所述基因表達(dá)序列連接到基因表達(dá)載體中；
[0016] 步驟三、將所述基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，得到重組細(xì)胞；
[0017] 步驟四、對(duì)所述重組細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體；
[0018] 步驟五、將所述菌體裂解，收集裂解粗產(chǎn)物；以及
[0019] 步驟六、利用Ni-親和柱純化所述裂解粗產(chǎn)物，得到所述突變型TaqDNA聚合酶。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述基因表達(dá)序列包括：
[0021] (a)、SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列；
[0022] (b)、與SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列具有至少98%同源性的核苷酸序列；或
[0023] (c)、SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)堿基被缺失、替代或增加得 到的核苷酸序列。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述基因表達(dá)載體為pET_28a。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述原核細(xì)胞為BL21。
[0027] -種酶制劑，包括權(quán)利要求上述的突變型TaqDNA聚合酶。
[0028] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述酶制劑還包括用于提高酶活性的金屬陽(yáng)離子。
[0029] 上述的突變型TaqDNA聚合酶在制備PCR反應(yīng)試劑領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0030] 這種突變型TaqDNA聚合酶，將野生型TaqDNA聚合酶的第605位由亮氨酸突變 為精氨酸，第617位由精氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?67位由苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?，并將T3 DNA聚合酶的TBD區(qū)即262~337位氨基酸替代TaqDNA聚合酶拇指區(qū)的480~485位氨 基酸。上述定點(diǎn)突變使得突變型TaqDNA聚合酶的活性、耐受性等均有明顯的提高。這種突 變型TaqDNA聚合酶，由于具有較高的酶活性和耐受性，可用于免核酸提取的直接擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系中。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為一實(shí)施方式的突變型TaqDNA聚合酶制備方法的流程圖；
[0032] 圖2a為實(shí)施例3中野生型TaqDNA聚合酶與本發(fā)明制得的突變型TaqDNA聚合 酶的SDS-PAGE蛋白電泳圖；
[0033] 圖2b為實(shí)施例3中本發(fā)明制得的突變型TaqDNA聚合酶原酶液稀釋20倍的樣品 與原酶液的SDS-PAGE蛋白電泳圖；
[0034] 圖3a為突變型TaqDNA聚合酶的活性檢測(cè)結(jié)果；
[0035] 圖3b為野生型TaqDNA聚合酶的活性檢測(cè)結(jié)果；
[0036] 圖4a為熒光定量PCR檢測(cè)fermentas的TaqDNA聚合酶對(duì)核酸提取后的HBV靈 敏度模板檢出率結(jié)果；
[0037] 圖4b為熒光定量PCR檢測(cè)突變型TaqDNA聚合酶對(duì)免核酸提取后的HBV靈敏度 模板檢出率結(jié)果；
[0038] 圖4c為熒光定量PCR檢測(cè)野生型TaqDNA聚合酶對(duì)免核酸提取后的HBV靈敏度 模板檢出率結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)突變型TaqDNA聚合酶及其制備方法和應(yīng)用做 進(jìn)一步的解釋說(shuō)明。
[0040] 由于野生型TaqDNA聚合酶結(jié)構(gòu)上的缺陷，使得其熱穩(wěn)定性和特異性較差，活性和 耐受性較低，在許多應(yīng)用領(lǐng)域受到限制。
[0041] 因此，本發(fā)明提供一種突變型TaqDNA聚合酶，通過(guò)對(duì)野生型TaqDNA聚合酶定點(diǎn) 突變，使得突變型TaqDNA聚合酶具有良好的熱穩(wěn)定性和特異性，并且活性、耐受性均有明 顯的提尚。
[0042] 一個(gè)實(shí)施方式的突變型TaqDNA聚合酶包括：
[0043] (a)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸編碼得到的多肽；
[0044] (b)、與SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98%同源性的多 核苷酸編碼得到的多肽；或
[0045] (c)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，其中一個(gè)或多個(gè)堿基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0046] 特別的，野生型TaqDNA聚合酶包括與SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多 核苷酸具有至少99%同源性的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0047] 另一實(shí)施方式的突變型TaqDNA聚合酶包括：
[0048] (a)、由SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽；
[0049] (b)、與SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98%同源性的多肽； 或
[0050] (c)、由SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺 失、替代或增加得到的多肽。
[0051] 特別的，野生型TaqDNA聚合酶包括與SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的多 肽具有至少99%同源性的多肽。
[0052] 由于同一氨基酸可由幾種不同的密碼子來(lái)決定，故同一氨基酸可對(duì)應(yīng)不同的核苷 酸序列。因此本申請(qǐng)中的突變型TaqDNA聚合酶的氨基酸序列，包括SEQIDN0. 2所示的 氨基酸序列，除可由SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列所編碼，也可由SEQIDNO. 1所示核苷 酸序列進(jìn)行1個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的密碼子同義突變的核苷酸序列所編碼得到。本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本申請(qǐng)公開的突變型TaqDNA聚合酶的氨基酸序列，根據(jù)現(xiàn)有分子 生物學(xué)技術(shù)，采用cDNA克隆和定點(diǎn)突變的方法或其他適合的方法獲得本申請(qǐng)的突變型Taq DNA聚合酶，因此，編碼上述突變型TaqDNA聚合酶的核苷酸序列并不僅限于SEQIDNO.