縮膠恒壓 100V，分離膠恒壓180V，跑膠結(jié)束后用考馬氏亮藍染色考馬氏亮藍染色。結(jié)果如圖2-b所 示，圖中2b-l泳道為20倍稀釋樣品，2b-2泳道為原酶樣品。通過比較原酶中雜帶與稀釋 后主帶的強度，從圖2-b可以看出，膠面背景干凈，樣品條帶清晰，原酶中雜帶強度〈稀釋后 主帶的強度，說明突變型TaqDNA聚合酶純度大于95%，純度合格。
[0114] 實施例4突變型TaqDNA聚合酶與野生型TaqDNA聚合酶的性能比較
[0115] (1)酶活性比較
[0116] 將本發(fā)明制備的突變型TaqDNA聚合酶和野生型TaqDNA聚合酶用熒光定量PCR 方法進行酶活比較。將突變型TaqDNA聚合酶與野生型TaqDNA聚合酶在同一實驗條件下 進行檢測，具體的，將兩種酶各自在模板濃度為104copies/ml和50copies/ml條件下進行 檢測，在本例中，將兩種酶分別在模板濃度為l〇4copies/ml的高濃度模板和50copies/ml 低濃度模板下各進行了 2次和6次重復檢測。結(jié)果如圖3a和圖3b所示，其中圖3a為突變 型TaqDNA聚合酶的活性檢測結(jié)果，圖3b為野生型TaqDNA聚合酶的活性檢測結(jié)果。圖中 每條曲線代表一個PCR反應，圖中的橫坐標表不PCR的循環(huán)次數(shù)，縱坐標表不焚光值。圖3a 中的3a_l為突變型TaqDNA聚合酶在高濃度模板下的一組曲線，3a_2為突變型TaqDNA聚 合酶在低濃度模板下的一組曲線。圖3b中的3b_l為野生型TaqDNA聚合酶在高濃度模板 下的一組曲線，3b-2為野生型TaqDNA聚合酶在低濃度模板下的一組曲線。圖中每組曲線 中所含有的曲線條數(shù)代表該酶在同一個濃度模板進行重復檢測的次數(shù)，每條曲線的高度則 代表檢測時在該濃度下該酶的PCR的擴增效率。本例中，高濃度模板下重復2次檢測，低濃 度模板下重復6次檢測。對比圖3a和圖3b可知，在高濃度模板的檢測中，3a-l組與3b-l 組曲線的高度相差不大，即該條件下突變型TaqDNA聚合酶與野生型TaqDNA聚合酶的PCR 擴增效率相差不大；但在低濃度模板的檢測中，3a_2組與3b_2組的熒光值和檢出率存在明 顯差異，突變型TaqDNA聚合酶檢測的熒光值和檢出率明顯高于野生型，即突變型TaqDNA 聚合酶的擴增效率遠大于野生型TaqDNA聚合酶。由此可得，本發(fā)明得到的突變型TaqDNA 聚合酶的活性比野生型TaqDNA聚合酶的活性有明顯的提高。
[0117] (2)酶耐受性比較
[0118] 選擇HBV血清樣品稀釋至500IU/mL。分為三組實驗，第一組：取10管10yL樣品 進行核酸提取，在含fermentas的TaqDNA聚合酶的體系中擴增；第二組：取10管10yL樣 品，不進行核酸提取操作，直接加入含本申請中突變型TaqDNA聚合酶的體系進行擴增；第 三組：取10管10yL樣品不進行核酸提取操作，直接加入含野生型TaqDNA聚合酶的體系 中擴增。通過三組實驗的靈敏度模板的檢出率的比較來評估本申請中突變型TaqDNA聚合 酶對生物樣本中PCR抑制劑的耐受程度。
[0119] 結(jié)果如圖4a、圖4b和圖4c所示。其中，圖4a為焚光定量PCR檢測fermentas的 TaqDNA聚合酶對核酸提取后的HBV靈敏度模板檢出率結(jié)果（10/10)，圖4b為熒光定量PCR 檢測突變型TaqDNA聚合酶對免核酸提取后的HBV靈敏度模板檢出率結(jié)果（10/10)，圖4c 為熒光定量PCR檢測野生型TaqDNA聚合酶對免核酸提取后的HBV靈敏度模板檢出率結(jié)果 (2/10)。同上，圖中每條曲線代表一個PCR反應，圖中的橫坐標表示PCR的循環(huán)次數(shù)，縱坐標 表示焚光值。對比圖4a和圖4b可知，在靈敏度模板相同時，采用核酸提取后用fermentas 的TaqDNA聚合酶再擴增與免核酸提取用該突變型TaqDNA聚合酶直接擴增的檢測方法二 者的檢出率一致，說明同一濃度的生物樣本免核酸提取用突變型TaqDNA聚合酶直接擴增 的檢測結(jié)果可以達到傳統(tǒng)核酸提取后再擴增的檢測效果，同時，免核酸提取縮短了檢測時 間，簡化了操作流程，具有一定的優(yōu)越性。對比圖4b和圖4c可知，免核酸提取用野生型Taq DNA聚合酶直接擴增的對HBV靈敏度模板的檢出率明顯低于免核酸提取用突變型TaqDNA 聚合酶直接擴增的檢出率，且熒光曲線較差，熒光值較低，說明突變型的TaqDNA聚合酶對 PCR抑制劑有較好的耐受性。
[0120] 在其他的生物樣品（如血清、血漿、體液、分泌物或排泄物等，如棉拭子、糞便等樣 本須進行預處理后使用）中，不進行核酸提取操作，直接加入含本申請中突變型TaqDNA聚 合酶的體系，也能實現(xiàn)PCR擴增，并具有良好的重復性和檢測靈敏度。
[0121] 以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的一種或幾種實施方式，其描述較為具體和詳 細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā) 明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。
【主權(quán)項】
1. 一種突變型Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述突變型Taq DNA聚合酶包括： (a) 、由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸編碼得到的多肽； (b) 、與SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷 酸編碼得到的多肽；或 (c) 、由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，其中一個或多個堿基被缺失、 替代或增加得到的多核苷酸編碼得到的多肽。2. -種突變型Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述突變型Taq DNA聚合酶包括： (a) 、由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的多肽； (b) 、與SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少98%同源性的多肽；或 (c) 、由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的多肽，其中一個或多個氨基酸被缺失、替 代或增加得到的多肽。3. -種突變型Taq DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一、提供用于表達突變型Taq DNA聚合酶的基因表達序列，所述突變型Taq DNA聚 合酶包括：（a)、由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的多肽；（b)、與SEQ ID No. 2所示的 氨基酸序列組成的多肽具有至少98%同源性的多肽；或（c)、由SEQ ID No.2所示的氨基酸 序列組成的多肽，其中一個或多個氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽； 步驟二、將所述基因表達序列連接到基因表達載體中； 步驟三、將所述基因表達載體轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，得到重組細胞； 步驟四、對所述重組細胞進行誘導表達，收集菌體； 步驟五、將所述菌體裂解，收集裂解粗產(chǎn)物；以及 步驟六、利用Ni-親和柱純化所述裂解粗產(chǎn)物，得到所述突變型Taq DNA聚合酶。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變型Taq DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述基因表 達序列包括： (a) 、SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列； (b) 、與SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列具有至少98%同源性的核苷酸序列；或 (c) 、SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，其中一個或多個堿基被缺失、替代或增加得到的 核苷酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變型Taq DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述基因表 達載體為pET-28a。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變型Taq DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述宿主細 胞為原核細胞。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的突變型Taq DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述原核細 胞為BL21。8. -種酶制劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1或2中所述的突變型Taq DNA聚合酶。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的酶制劑，其特征在于，所述酶制劑還包括用于提高酶活性的 金屬陽離子。10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的突變型Taq DNA聚合酶在制備PCR反應試劑領(lǐng)域中的 應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種突變型Taq？DNA聚合酶，將野生型Taq？DNA聚合酶氨基酸序列突變，具體的為將野生型Taq？DNA聚合酶的第605位由亮氨酸突變?yōu)榫彼?，?17位由精氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?67位由苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?，并將T3？DNA聚合酶的TBD區(qū)即262～337位氨基酸替代Taq？DNA聚合酶拇指區(qū)的480～485位氨基酸。上述定點突變使得突變型Taq？DNA聚合酶的活性、耐受性等均有明顯的提高。這種突變型Taq？DNA聚合酶，由于具有較高的酶活性和耐受性，可用于免核酸提取的直接擴增PCR反應體系中。本發(fā)明還公開了上述突變型Taq？DNA聚合酶的制備方法及應用。
【IPC分類】C12N15/10, C12N15/54, C12N15/70, C12N9/12
【公開號】CN105039278
【申請?zhí)枴緾N201510338457
【發(fā)明人】鄧艷華, 楊浩, 李泓彥
【申請人】菲鵬生物股份有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年6月17日