Il-4檢測引物、試劑盒和半定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細胞因子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種IL-4檢測引物、試劑盒和半定 量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細胞因子是免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導(dǎo)多種細胞產(chǎn)生的低分子量可溶性蛋 白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、細胞生長以及損傷組織修復(fù)等多種功能。細胞因 子可被分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子 等。其中，比較重要的有IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IFN-y、TNF-f3和神經(jīng)白細胞素等，在細 胞間相互作用、免疫調(diào)節(jié)、造血以及炎癥過程中起重要調(diào)節(jié)作用。
[0003] 已經(jīng)有諸多的文獻和研究成果表明，IL-4表達水平與多種疾病和機體免疫密切相 關(guān)。通過對IL-4表達水平的檢測，可以利于很多必要信息的更早獲取以及相關(guān)某些疾病的 早期診斷。而現(xiàn)有IL-4的檢測中常使用免疫學(xué)測定法，比如使用率最高的ELISA試劑盒； 但是現(xiàn)有的這些檢測的試劑盒或者方法，其檢測針對的是IL-4分泌、吸附、消耗和降解后 的凈含量，不是細胞因子產(chǎn)生過程中基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后調(diào)控機制提供必要的信息，也 不能反映細胞或組織內(nèi)實時的細胞因子基因表達水平，所以檢測的結(jié)果不能作為IL-4指 標(biāo)實時定點檢測真實情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明實施的目的在于克服現(xiàn)有的缺陷，提供一種能更真實和準(zhǔn)確檢測細胞或組 織內(nèi)實時的IL-4表達水平的IL-4檢測引物、試劑盒和半定量檢測方法。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實施例的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種IL-4檢測引物，包括具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的引物P1、具有序列 表SEQ. ID. No. 2堿基序列的引物P2。
[0007] 基于上述檢測引物，本發(fā)明還提出包括上述引物的IL-4檢測試劑盒。
[0008] 本發(fā)明的上述引物基于基因表達過程中編碼IL-4的mRNA合成遠先于分泌的 IL-4蛋白產(chǎn)物，且蛋白質(zhì)的表達量的多少與對應(yīng)編碼的mRNA的量成線性正比的關(guān)系；通過 RT-PCR方式擴增對應(yīng)編碼的mRNA，再通過mRNA的量即可得到對應(yīng)IL-4蛋白產(chǎn)物的量；其 檢測的不是IL-4分泌、吸附、消耗和降解后的凈含量，而是IL-4產(chǎn)生過程中基因轉(zhuǎn)錄、翻譯 及翻譯后調(diào)控機制的實時定點水平；其能更真實和準(zhǔn)確反應(yīng)細胞或組織內(nèi)實時的IL-4表 達水平。
[0009] 本發(fā)明基于上述引物和試劑盒，進一步提出一種采用上述引物構(gòu)建競爭性RT-PCR 進行IL-4半定量檢測方法，包括如下步驟：
[0010] 獲取IL-4對照組細胞和IL-4待測組細胞；
[0011] 提取所述IL-4對照組細胞的總RNA，并用具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的引 物P1和具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列的競爭性引物P3進行RT-PCR，得到競爭模板；
[0012] 提取所述IL-4待測組細胞的總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄獲得待測cDNA模板；
[0013] 將所述待測cDNA模板和競爭模板混合后，用具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的 引物P1和具有序列表SEQ. ID. No. 2堿基序列的引物P2進行PCR，得到靶序列擴增產(chǎn)物。
[0014] 上述方法的過程，通過引物平P1和引物P2擴增的IL-4cDNA靶片段長474bp，而用 引物P1和引物P3擴增的管家基因長454bp，比靶片段短22bp ;競爭模板與靶片段序列差異 小，在作競爭PCR時可將影響因素降至低水平，從而使檢測結(jié)果更能反映樣本的真實情況； 且所用的競爭模板與靶序列電泳位置接近，為判斷RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶提供了較理想的 參照物，可避免對非特異性條帶的誤判通過測定電泳帶的密度，即可對靶序列的擴增產(chǎn)物 進行定量，從而推知所測樣本中相應(yīng)mRNA的含量，更加接近真實的表達水平。
【具體實施方式】
[0015] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0016] 本發(fā)明實例提出一種IL-4檢測引物，包括具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的引 物P1、具有序列表SEQ. ID. No. 2堿基序列的引物P2。
[0017] 本發(fā)明的上述檢測的引物，與現(xiàn)有的免疫學(xué)測定法的方法和ELISA試劑盒的檢測 內(nèi)容上不同。本發(fā)明的立意是基于細胞中表達蛋白質(zhì)時，基因表達過程中編碼IL-4的mRNA 合成遠先于分泌的IL-4蛋白產(chǎn)物，且蛋白質(zhì)的表達量的多少與對應(yīng)編碼的mRNA的量成線 性正比的關(guān)系；所以本發(fā)明采用上述特異性的引物通過RT-PCR方式擴增對應(yīng)編碼的mRNA， 再通過mRNA的量即可得到對應(yīng)IL-4蛋白產(chǎn)物的量。而且本發(fā)明的半定量檢測引物和方 法，相比現(xiàn)有的檢測方法和試劑盒，其能具有的優(yōu)勢在于其檢測的不是IL-4分泌、吸附、消 耗和降解后的凈含量，而是IL-4產(chǎn)生過程中基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后調(diào)控機制的實時定點 水平；其能反應(yīng)細胞或組織內(nèi)實時的IL-4表達水平。
[0018] 在上述IL-4檢測引物中含有的是一組上下游引物，其中引物P1為上游引物、而引 物P2是下游引物，單一進行RT-PCR擴增，其擴增的結(jié)果在沒有內(nèi)參或者是對比的情況下， 單個的IL-4的mRNA不方便進行準(zhǔn)確的定量。所以在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明的上述IL-4檢測 引物進一步包括具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列的競爭性引物P3。
[0019] 該競爭性引物P3的設(shè)計是以P-actin(肌動蛋白）的基因設(shè)計的引物，其中需 要進一步仔細的說明的是0-actin基因是屬于管家基因，在哺乳動物細胞表達中是由管 家基因編碼表達的蛋白，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，且其產(chǎn)物是對維持細胞 基本生命活動所必需的，可以作為半定量中的比對參照物。在進行半定量RT-PCR時，選擇 管家基因可以通過計算目的基因和內(nèi)參的比值，得到基因表達的相對濃度，從而輔助判斷 RT-PCR的整個體系和反應(yīng)條件是否合適，以及PCR的結(jié)果情況。
[0020] 通過該競爭性引物P3的引物與上述引物P1共同組成引物對，同時擴增IL-4基因 片段（即靶序列）和0 -actin基因片段（內(nèi)參序列），擴增過程中靶序列和競爭性序列均 用相同的引物對以相同的效率擴增，兩序列的初始化比值在整個反應(yīng)過程中保持不變，得 到競爭性的cDNA模板。然后再以該競爭性的cDNA模板分別用IL-4引物對和0 -actin引 物對進行單獨擴增；通過0-actin蛋白mRNA擴增產(chǎn)量（擴增過程中0-actin的引物可 以自行設(shè)計，或者采用本發(fā)明下述設(shè)計的引物P4和P5)的結(jié)果，即可作為相對確定IL-4的 mRNA表達水平的對照，便于本發(fā)明IL-4檢測中的定量分析。
[0021] 進一步在上述檢測的引物的基礎(chǔ)上，為了便于競爭性RT-PCR中0-actin蛋白 mRNA量的檢測，進一步提出輔助用于0 -actin蛋白mRNA擴增的引物，包括具有序列表 SEQ. ID. No. 4堿基序列的引物P4、具有序列表SEQ. ID. No. 5堿基序列的引物P5。這一組引 物P4和引物P5組成的引物對是以上述構(gòu)建的競爭性cDNA模板擴增0 -actin蛋白mRNA 進行檢測的引物對，便于IL-4檢測的分析參考和比對。
[0022] 當(dāng)然，上述引物的特異性和擴增的穩(wěn)定性，反復(fù)的經(jīng)過BLEAST比對檢測以及多次 的試驗驗證，穩(wěn)定性和特異性比較好，能夠達到檢測的目的和半定量分析的要求。
[0023] 同時，本發(fā)明的上述引物對是基于RT-PCR和競爭性RT-PCR設(shè)計的引物，所以引物 對在使用過程中，技術(shù)人員根據(jù)領(lǐng)域的常規(guī)RT-PCR和競爭性RT-PCR的實施步驟進行即可。 其中，引物的信息如下表所示：
[0024]
[0026] 基于本發(fā)明的上述IL-4檢測引物的提出，本發(fā)明進一步還提出一種IL-4半定量 檢測試劑盒產(chǎn)品；本發(fā)明的試劑盒產(chǎn)品包括上述具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的引物 P1、以及具有序列表SEQ. ID. No. 2堿基序列的引物P2。該試劑盒實施的過程中其機理和理 由可以參見上述引物部分對應(yīng)的描述，本部分