^1)0.5 4 1、5\厶1^1311打6『2 4 1、用0￡?(：水補足至10y 1 ；
[0050] 按照上述體系，進行 42°C下 60min、95°C下 4min、4°C下 5min。
[0051] S23,將步驟S22反轉錄完成后的產(chǎn)物，進行PCR擴增；擴增體系按照：步驟S30的 反轉錄cDNA模板3 y l、20pmol/ y 1的引物P1、競爭性引物P3各1 y 1，dNTP 2 y 1、Taq酶 0? 5 y 1 (5U/ y 1)、DD-H20 12. 5 y 1 ;
[0052] 將上述體系于95°C下60s、66°C下次40s、72°C下45s，以上步驟重復循環(huán)28次后 于72°C下5min即可。
[0053] S24,在步驟S23擴增完成之后，得到的擴增的條帶是否具有靶序列的cDNA，且得 到的該cDNA的量是多少，需要進行驗證和計算，在該步驟S24中進行，具體可以按照：
[0054] 將步驟S23得到的擴增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖電泳，于紫外分析儀下切割目的條帶，按 試劑盒說明操作回收競爭模板，測定含量，同時分別以引物P1和引物P2為引物對回收的競 爭模板進行PCR，用以確定經(jīng)競爭模板的合適用量，分裝后作為競爭模板_80°C凍存，備用；
[0055] S30,獲取一待測患者的外周血單個核細胞（大致也按照與步驟S11中相同的細胞 濃度約為2X 106/ml)，然后直接用RNA試劑盒提取總RNA(A260nm/A280nm>l. 7)，并參照步 驟S22相同的體系進行反轉錄，獲取待測cDNA模板；
[0056] S40,將步驟S30獲得的待測cDNA模板3 y 1、以及同樣量步驟S24制備的競爭模板 混合，混合后用引物P1和引物P2進行PCR擴增；其中PCR的體系和具體過程參見步驟S23 的實施細節(jié)進行。
[0057]S50，為了步驟S40進行對照，將步驟S30獲得的待測cDNA模板3 y 1用引物P4和 引物P5進行PCR擴增，該步驟中PCR擴增體系也參考步驟S23的PCR體系進行；
[0058] 該步驟S50的PCR是為了檢測待測cDNA模板中0 -actin的mRNA量的情況，用來 作為步驟S40中IL-4的對照。
[0059] S60,按上述步驟S40和步驟S50進行競爭性RT-PCR的產(chǎn)物，經(jīng)3%瓊脂糖電泳，在 SX-100image system上攝像、以已知濃度的競爭模板定標作密度定量，推知相應mRNA的相 對含量。
[0060] 經(jīng)過計算和比對，上述步驟S11中健康人經(jīng)過2. 0 ymol/L的|丐離子載體和80ng/ ml PMA誘導7h后，其細胞中IL-4的mRNA為8. 10±0. 61ng作為對比參照（選用誘導之后 的健康細胞作為參照是因為不經(jīng)過誘導而直接測的細胞中IL-4的mRNA為0. 18±0. 13ng， 其表明健康人單個核細胞的IL-4基本上是不表達的，而且這個檢測結果名顯方差過大，因 此不太能用作定量參考），而待測細胞中IL-4的mRNA為6. 73±0. 58ng。
[0061] 同樣再檢測IL-4的ELISA免疫試劑盒檢測上述步驟S30獲取的待測的細胞中 IL-4的mRNA為4. 18 ±0. 43ng，這個結果比上述檢測的方法得到的結果明顯低了約38 %，所 以本發(fā)明的上述檢測上可能更能體現(xiàn)真實的表達水平。
[0062] 其中本發(fā)明的上述實施例1中進行檢測的過程是用于檢測組織細胞的相關腫瘤 化或者癌變的情況，而進一步本發(fā)明的上述方法過程用于檢測IL-4的大量生產(chǎn)制備的發(fā) 酵培養(yǎng)的細胞和種子細胞的IL-4表達水平時，也可以用上述同等的方法構建對照和待測， 從而得到所要檢測的發(fā)酵培養(yǎng)的細胞和種子細胞的IL-4表達水平。具體的實施過程參見 上述過程替換實施即可，這一部分不再贅述。
[0063] 采用上述方法的過程通過引物平P1和引物P2擴增的IL_4cDNA靶片段長474bp， 而用引物P1和引物P3擴增的管家基因長454bp，比靶片段短22bp ;競爭模板與靶片段序列 差異小，在作競爭PCR時可將影響因素降至低水平，從而使檢測結果更能反映樣本的真實 情況；且所用的競爭模板與靶序列電泳位置接近，為判斷RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶提供了較理 想的參照物，可避免對非特異性條帶的誤判通過測定電泳帶的密度，即可對靶序列的擴增 產(chǎn)物進行定量，從而推知所測樣本中相應mRNA的含量，更加接近真實的表達水平。
[0064] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包括在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種IL-4檢測引物，其特征在于，包括具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的引物 Pl、具有序列表SEQ. ID. No. 2堿基序列的引物P2。2. 如權利要求1所述的IL-4檢測引物，其特征在于，還包括具有序列表SEQ. ID. No. 3 堿基序列的競爭性引物P3。3. -種IL-4檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求1或2所述的IL-4檢測引物。4. 如權利要求3所述的IL-4檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括具有序列表 SEQ. ID. No. 4堿基序列的引物P4、具有序列表SEQ. ID. No. 5堿基序列的引物P5。5. 如權利要求3或4所述的IL-4檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括RNase 抑制劑，且該RNase抑制劑為焦碳酸二乙酯。6. 如權利要求3或4所述的IL-4檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PMA和 /或鈣離子載體。7. -種IL-4半定量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： 獲取IL-4對照組細胞和IL-4待測組細胞； 提取所述IL-4對照組細胞的總RNA，并用具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的引物Pl 和具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列的競爭性引物P3進行RT-PCR，得到競爭模板； 提取所述IL-4待測組細胞的總RNA，并進行反轉錄獲得待測cDNA模板； 將所述待測cDNA模板和競爭模板混合后，用具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的引物 Pl和具有序列表SEQ. ID. No. 2堿基序列的引物P2進行PCR，得到靶序列擴增產(chǎn)物。8. 如權利要求8所述的IL-4半定量檢測方法，其特征在于，將所述待測cDNA模板和競 爭模板混合后，用具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的引物Pl和具有序列表SEQ. ID. No. 2 堿基序列的引物P2進行PCR步驟之后，還包括： 將所述待測cDNA模板用具有序列表SEQ. ID. No. 4堿基序列的引物P4和具有序列表 SEQ. ID. No. 5堿基序列的引物P5進行RCR，得到對照擴增產(chǎn)物。9. 如權利要求8所述的IL-4半定量檢測方法，其特征在于，將所述待測cDNA模板用具 有序列表SEQ. ID. No. 4堿基序列的引物P4和具有序列表SEQ. ID. No. 5堿基序列的引物P5 進行RCR步驟之后，還包括： 根據(jù)靶序列擴增產(chǎn)物和對照擴增產(chǎn)物計算所述IL-4待測組細胞中IL-4的mRNA量。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種IL-4檢測引物，包括具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的引物P1、具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的引物P2。本發(fā)明的上述引物基于基因表達過程中編碼IL-4的mRNA合成遠先于分泌的IL-4蛋白產(chǎn)物，且蛋白質的表達量的多少與對應編碼的mRNA的量成線性正比的關系；通過RT-PCR方式擴增對應編碼的mRNA，再通過mRNA的量即可得到對應IL-4蛋白產(chǎn)物的量；其檢測的不是IL-4分泌、吸附、消耗和降解后的凈含量，而是IL-4產(chǎn)生過程中基因轉錄、翻譯及翻譯后調控機制的實時定點水平；其能更真實和準確反應細胞或組織內實時的IL-4表達水平。在上述引物的基礎上，本發(fā)明還進一步提出包括上述IL-4檢測引物檢測試劑盒、以及利用上述引物進行半定量檢測的方法。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105039548
【申請?zhí)枴緾N201510448282
【發(fā)明人】曾憲卓, 魯菲
【申請人】深圳愛生再生醫(yī)學科技有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年7月28日