一種相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞遺傳工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 染色體相互易位是指非同源染色體的染色質(zhì)發(fā)生交換而引起的染色體結(jié)構(gòu)變化， 其在新生兒中的發(fā)生率約為1/500至1/6251。染色體相互易位攜帶者往往沒有臨床表型， 因此常常被稱為染色體相互易位攜帶者。然而由于在減數(shù)分裂過程中染色體的異常分離， 會(huì)產(chǎn)生很大比例的染色體異常的配子。對于非Robertsonian易位攜帶者來說，理論上僅能 產(chǎn)生1/18完全正常的配子，1/18攜帶相互易位染色體的配子，其余均為異常配子。這些配 子受精后會(huì)形成部分三體或者部分單體的受精卵，容易導(dǎo)致胚胎發(fā)生早期流產(chǎn)。目前通過 熒光原位雜交（FISH)、基因芯片（SNP Array)以及新一代測序（NGS)技術(shù)對由于相互易位 異常減數(shù)分裂導(dǎo)致的部分三體或者部分單體胚胎進(jìn)行植入前遺傳學(xué)診斷（PGD)的技術(shù)已 經(jīng)十分成熟。然而，目前還沒有一種臨床上可以接受的方法在胚胎植入前將染色體完全正 常的胚胎和攜帶相互易位染色體的胚胎區(qū)分開來。相互易位攜帶者仍有可能生育攜帶相互 易位染色體的后代，該后代到了生育年齡仍然面臨由于反復(fù)流產(chǎn)而求助于PGD進(jìn)行輔助生 殖的窘境。
[0003]尋找相互易位斷點(diǎn)一直是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。目前尋找相互易位斷點(diǎn)的 主要方法有熒光原位雜交（FISH) +染色體步移法、相互易位染色體流式分選+新一代測序 技術(shù)（Next Generation Sequencing, NGS)、FISH+ 區(qū)域捕獲 +NGS 及環(huán)化建庫 +NGS 等。早 期尋找相互易位染色體斷點(diǎn)的方法需要通過原位雜交確定大概的染色體位置，再通過染色 體步移測序?qū)ふ覕帱c(diǎn)，方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且由于基因組結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，成功率不高。隨著測序 技術(shù)的進(jìn)步，測序成本迅速降低，大規(guī)模序列分析也逐步變?yōu)榭赡?。人們逐步采用NGS技術(shù) 對基因組進(jìn)行分析，從而尋找相互易位染色體斷點(diǎn)。2008年德國Ropers研究小組采用特殊 的流式細(xì)胞分選術(shù)分選相互易位染色體，再對分選后的染色體進(jìn)行NGS分析，從而找到斷 點(diǎn)。這一技術(shù)需要特殊的流式細(xì)胞儀和分選技術(shù)，測序成本也很高，難于推廣和臨床應(yīng)用。 2011年美國約翰霍普金斯大學(xué)和哈弗大學(xué)的兩個(gè)獨(dú)立小組均報(bào)道了運(yùn)用區(qū)域捕獲技術(shù)結(jié) 合NGS技術(shù)進(jìn)行斷點(diǎn)查找的工作，這一方法雖然可以大大減少測序通量，然而需要設(shè)計(jì)特 殊的捕獲芯片，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，仍然難以應(yīng)用于臨床。2012年新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志報(bào)道了美國哈弗 大學(xué)的新研究成果，利用DNA環(huán)化建庫結(jié)合NGS技術(shù)進(jìn)行斷點(diǎn)尋找。該方法無需進(jìn)行中期 核分裂相的制備，可以利用DNA直接進(jìn)行環(huán)化建庫，分析斷點(diǎn)信息，將斷點(diǎn)分析又向臨床推 進(jìn)了一步。然而，該方法需要用到特殊的建庫方法，測序量仍然較大（約需測序兩億八千萬 reads)，在臨床應(yīng)用上仍有一定困難。目前還沒有一種合適的方法進(jìn)行相互易位染色體斷 點(diǎn)分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，有必要提供一種快速有效的相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法。
[0005] -種相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法，包括如下步驟：
[0006] 步驟S1，制作細(xì)胞周期處于有絲分裂中期的細(xì)胞樣本；
[0007] 步驟S2,收集所述細(xì)胞樣本，進(jìn)行染色體顯帶操作，選取條帶清晰的樣本；
[0008] 步驟S3,在所述樣本上找到相互易位的染色體，切割下易位染色體斷點(diǎn)附近的染 色質(zhì)，并對切割下的染色質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增處理；
[0009] 步驟S4,對擴(kuò)增處理后的染色質(zhì)進(jìn)行NGS測序分析，并將測序結(jié)果比對至人類基 因組上，獲得相互易位染色體的斷點(diǎn)位置。
[0010] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟S1中，所述細(xì)胞樣本為外周血細(xì)胞樣本。
[0011] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟S1包括如下步驟：將肝素抗凝外周血接種至含 PHA的RPMI1640培養(yǎng)基中，37°C恒溫箱培養(yǎng)72小時(shí)后加入五氟尿嘧啶和尿嘧啶核苷，繼續(xù) 培養(yǎng)17小時(shí)后加入胸腺嘧啶核苷，再在5小時(shí)后加入秋水仙素，再在2小時(shí)后收集得到所 述細(xì)胞樣本。
[0012] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟S2包括如下步驟：
[0013] 步驟S21，向所述細(xì)胞樣本中加入低滲液進(jìn)行低滲處理；
[0014] 步驟S22,向低滲處理后的所述細(xì)胞樣本中加入固定液進(jìn)行固定處理，并制備固定 后的細(xì)胞懸液；
[0015] 步驟S23,對所述細(xì)胞懸液進(jìn)行滴片處理，制得細(xì)胞滴片；
[0016] 步驟S24,對所述細(xì)胞滴片進(jìn)行染色處理；
[0017] 步驟S25,染色處理后，進(jìn)行鏡檢，選取中期染色體形態(tài)分散良好、條帶清晰的樣 本。
[0018] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，在步驟S21中，所述低滲液是濃度為0. 075M的KC1溶液；
[0019] 在步驟S22中，所述固定液是體積比為3:1的甲醇與乙酸的混合液體，所述細(xì)胞懸 液是按照0. 5mL外周血培養(yǎng)收獲的細(xì)胞制備2mL細(xì)胞懸液的標(biāo)準(zhǔn)制備。
[0020] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，在所述步驟S23中，在滴片過程中，保持60-lOOcm的高度進(jìn) 行滴片，每張蓋玻片中部滴一滴所述細(xì)胞懸液。
[0021] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，在所述步驟S24中，在進(jìn)行染色之前還包括對細(xì)胞滴片進(jìn) 行老化處理，并將老化處理后的細(xì)胞滴片置于胰蛋白酶溶液中消化處理的步驟，再對消化 處理后得到的細(xì)胞滴片進(jìn)行所述染色處理，其中，染色處理使用的染色液為Giemsa染色 液。
[0022] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，在所述步驟S3中，收集的易位染色體斷點(diǎn)附近的染色質(zhì)拷 貝數(shù)量為6-8個(gè)。
[0023] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟S3包括如下步驟：
[0024] 步驟S31，將樣本置于顯微鏡下找到相互易位的染色體，并切割下易位染色體斷點(diǎn) 附近的染色質(zhì)；
[0025] 步驟S32,將切割下的染色質(zhì)轉(zhuǎn)移入含有UN1引物的收集液中，進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增處理， 所述UN1引物的序列如SEQ ID No. 1所示；
[0026] 步驟S33,對將預(yù)擴(kuò)增處理得到溶液置于含有UN1引物的擴(kuò)增液中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增 處理。
[0027] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，在所述步驟S32中，所述收集液包括如下體積份數(shù)的各組 分：1 y L 的 5XT0P0 緩沖液、0? 5 y L 的 2mM dNTP、0. 1 y L 的 UN1 引物、3. 5 y L 的 dH20 以及 0. lyL的拓?fù)洚悩?gòu)酶I。
[0028] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，在所述步驟S32中，預(yù)擴(kuò)增的條件為：先94°C處理5min，然 后按照94°C lmin、30°C l_5min、37°C 3min循環(huán)4-15次，其中，每個(gè)循環(huán)在30°C處理時(shí)均需 向反應(yīng)體系中加入0. 2 y L的T7DNA測序酶。
[0029] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，在所述步驟S33中，所述擴(kuò)增液包括如下體積分?jǐn)?shù)的各組 分：5yL 的 10XPCR 緩沖液、5yL 的 2mM dNTP、lyL 的 UN1 引物、40yL 的 _ 以及 2.5U 的Taq DNA多聚酶。
[0030] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，在所述步驟S33中，所述PCR擴(kuò)增的條件為：先94°C處理 5min，然后按照 94°C lmin、56°C lmin、72°C 1.5min 循環(huán) 30 次，再 72°C 5min，最后于 16°C保 存。
[0031] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，在所述步驟S3之后，所述步驟S4之前，還包括對擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行PCR熒光標(biāo)記，并在有絲分裂中期核分裂相中進(jìn)行FISH，以驗(yàn)證顯微切割是否成功的 步驟。
[0032] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，在所述步驟S4中，包括構(gòu)建測序文庫、對構(gòu)建的測序文庫 進(jìn)行NGS測序以及對測序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的步驟。
[0033] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，在所述步驟S4之后還包括：
[0034] 在獲得的斷點(diǎn)位置附近設(shè)計(jì)引物，對樣本的gDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0035] 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證，獲取確切的斷點(diǎn)位置。
[0036] 上述相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法利用染色體顯微切割技術(shù)獲得易位染色體 斷點(diǎn)附近染色質(zhì)，再利用NGS技術(shù)測序分析，可以快速且相對價(jià)廉地進(jìn)行斷點(diǎn)的精確定位， 有利于對相互易位染色體進(jìn)行后續(xù)分析，如可以利用這些信息設(shè)計(jì)引物，對相互易位攜帶 者的PGD胚胎進(jìn)行診斷，分辨完全正常胚胎和攜帶相互易位染色體的胚胎，通過僅移植完 全正常的胚胎而阻斷相互易位染色體在該家族中的傳遞。
[0037] 該分析方法將染色體顯微切割技術(shù)和NGS技術(shù)結(jié)合起來形成一個(gè)新的 染色體顯微切割為基礎(chǔ)的NGS技術(shù)（Microdissection based next-generation sequencing, Micro-NGS)，通過染色體顯微切割技術(shù)快速特異地富集斷點(diǎn)附近染色質(zhì)，既可 減少后期測序通量和信息分析難度以降低成本，又可以快速獲得相互易位染色體斷點(diǎn)附近 的序列信息，精確尋找到斷點(diǎn)位置，為后期分析提供支持。
【附圖說明】
[0038] 圖1為一實(shí)施方式的相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法的流程示意圖；
[0039] 圖2為實(shí)施例的部分核型圖（a)及易位染色體涂探針FISH結(jié)果（b)和衍生染色 體跨斷點(diǎn)片段顯微切割產(chǎn)物反向雜交FISH驗(yàn)證結(jié)果，圖中，（c)為der(l)，（d)為der (2)， chr表示染色體，der表示衍生染色體，本實(shí)施例外周血核型為46, XX，t (1 ;2) (p31 ;ql3);
[0040] 圖3為NGS測序分析得到的斷點(diǎn)分析示意圖；
[0041]圖4為衍生4號(hào)染色體跨斷點(diǎn)DNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果（a)和Sanger測序圖（b)， 衍生9號(hào)染色體跨斷點(diǎn)DNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果（c)和Sanger測序圖（d)，其中，M為DNA maker，1泳道為實(shí)驗(yàn)者的gDNA，2泳道為正常人gDNA，黑色箭頭示斷裂連接點(diǎn)處；
[0042] 圖5為精確斷點(diǎn)序列圖。
【具體實(shí)施方式】
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