9)，去除重復(fù)比對(duì)到多個(gè)位 置的序列。
[0149] 檢測(cè)斷點(diǎn)
[0150] 根據(jù)序列比對(duì)數(shù)目，檢測(cè)目的染色體斷點(diǎn)位置，該位置區(qū)域所具有的特征包括：1、 兩個(gè)衍生染色體數(shù)據(jù)在該位置都有序列；2、每個(gè)衍生染色體數(shù)據(jù)在該區(qū)域的序列數(shù)目明顯 高于其他區(qū)域。
[0151] 6.PCR尋找斷點(diǎn)位置
[0152] 1)在預(yù)測(cè)斷點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物，對(duì)相互易位攜帶者gDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0153] 根據(jù)NGS測(cè)序結(jié)果預(yù)測(cè)一實(shí)施例（MD14009病例核型46, XX，t(4 ;9) (q21 ;q22))4 號(hào)染色體和9號(hào)染色體的斷點(diǎn)分別為chr4 :84877800 bp和chr9 :75640500 bp，調(diào)取預(yù)測(cè) 斷點(diǎn)兩側(cè)lkb范圍內(nèi)的參考DNA序列如SEQ IDNo. 2和SEQ ID No. 3所示，其中，DNA序列 調(diào)取網(wǎng)址：

[0159] 利用在線引物設(shè)計(jì)軟件（網(wǎng)址：
[0160]http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr ?hgsid= 438896971_ g2x8nfJhRMDeUR9A4FHac7kUylAC)設(shè)計(jì)衍生4號(hào)染色體跨斷點(diǎn)DNA片段PCR引物 (der(4))：
[0161]MD14009-CHR4-4F:5' -AGCATTTGCTTGTCTGTAAAGTA-3' （chr4:84877550-84877572 bp正向引物，SEQIDNo. 4)、
[0162]MD14009-CHR9-1R:5'-TAAGTTTTCATTTCAAACTGATTC-3' （chr9:75640856-75640879 bp反向引物，SEQIDNo. 5);
[0163] 設(shè)計(jì)衍生9號(hào)染色體跨斷點(diǎn)DNA片段PCR引物（der(9)):
[0164]MD14009-chr9-lF:5,-CCCGTGAGAATCAGATTTAACA-3, （chr9:75640370-75640391bp 正向引物，SEQIDNo. 6)、
[0165]MD14009-chr4-lR:5' -CCAAGAAATATGGGACTATGTGC-3' （chr4:84877998-84878020 反向引物，SEQIDNo. 7)。
[0166] 2)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序
[0167] PCR反應(yīng)體系如表6所示
[0168] 表6PCR反應(yīng)體系
[0169]
[0170]反應(yīng)程序：95°(：變性5111111。然后94°(：變性3〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8,35個(gè) 循環(huán)。最后72°C延伸5min，16°C保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，見(jiàn)圖4a和4c， 觀察到攜帶者gDNA特異的der (4)跨斷點(diǎn)約670bp條帶和der (9)跨斷點(diǎn)約290bp條帶，正 常對(duì)照gDNA均為陰性。
[0171] 3)PCR產(chǎn)物應(yīng)用雙脫氧單鏈終止法（Sanger測(cè)序法）測(cè)序驗(yàn)證斷點(diǎn)確切位置， 測(cè)序結(jié)果利用在線比對(duì)軟件與參考DNA序列比對(duì)分析（網(wǎng)址：http://genome. ucsc. edu/ cgi-bin/hgBlat ? hgsid = 427694565_AH8tf38aSdoTtDrjCRUL AoCdUsgz&command = start)，結(jié)果如圖5示，4號(hào)染色體精確斷點(diǎn)位置為chr4:84877905-84877912bp，且中間缺 失6bp ([crCCTGj) DNA序列。9號(hào)染色體精確斷點(diǎn)位置為chr9:75640555-75640556bp。4號(hào) 和9號(hào)染色體斷點(diǎn)處存GTT和GAT微小同源序列。4號(hào)染色體參考序列（斜體DNA序列）、 衍生4號(hào)染色體跨斷點(diǎn)序列（圖4b)、衍生9號(hào)染色體跨斷點(diǎn)序列（圖4d)和9號(hào)染色體參 考DNA序列（下劃線DNA序列）如下（斷點(diǎn)處上、下游25bp序列）：
[0176] 以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí) 施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存 在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。
[0177] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟S1，制作細(xì)胞周期處于有絲分裂中期的細(xì)胞樣本； 步驟S2,收集所述細(xì)胞樣本，進(jìn)行染色體顯帶操作，選取條帶清晰的樣本； 步驟S3,在所述樣本上找到相互易位的染色體，切割下易位染色體斷點(diǎn)附近的染色質(zhì)， 并對(duì)切割下的染色質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增處理； 步驟S4,對(duì)擴(kuò)增處理后的染色質(zhì)進(jìn)行NGS測(cè)序分析，并將測(cè)序結(jié)果比對(duì)至人類(lèi)基因組 上，獲得相互易位染色體的斷點(diǎn)位置。2. 如權(quán)利要求1所述的相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法，其特征在于，所述步驟Sl中， 所述細(xì)胞樣本為外周血細(xì)胞樣本。3. 如權(quán)利要求2所述的相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法，其特征在于，所述步驟Sl包 括如下步驟：將肝素抗凝外周血接種至含PHA的RPMI1640培養(yǎng)基中，37°C恒溫箱培養(yǎng)72小 時(shí)后加入五氟尿嘧啶和尿嘧啶核苷，繼續(xù)培養(yǎng)17小時(shí)后加入胸腺嘧啶核苷，再在5小時(shí)后 加入秋水仙素，再在2小時(shí)后收集得到所述細(xì)胞樣本。4. 如權(quán)利要求1所述的相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法，其特征在于，所述步驟S2包 括如下步驟： 步驟S21，向所述細(xì)胞樣本中加入低滲液進(jìn)行低滲處理； 步驟S22,向低滲處理后的所述細(xì)胞樣本中加入固定液進(jìn)行固定處理，并制備固定后的 細(xì)胞懸液； 步驟S23,對(duì)所述細(xì)胞懸液進(jìn)行滴片處理，制得細(xì)胞滴片； 步驟S24,對(duì)所述細(xì)胞滴片進(jìn)行染色處理； 步驟S25,染色處理后，進(jìn)行鏡檢，選取中期染色體形態(tài)分散良好、條帶清晰的樣本。5. 如權(quán)利要求4所述的相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法，其特征在于，在步驟S21中， 所述低滲液是濃度為〇. 075M的KCl溶液； 在步驟S22中，所述固定液是體積比為3:1的甲醇與乙酸的混合液體，所述細(xì)胞懸液是 按照0. 5mL外周血培養(yǎng)收獲的細(xì)胞制備2mL細(xì)胞懸液的標(biāo)準(zhǔn)制備；在所述步驟S23中，在滴 片過(guò)程中，保持60-lOOcm的高度進(jìn)行滴片，每張蓋玻片中部滴一滴所述細(xì)胞懸液； 在所述步驟S24中，在進(jìn)行染色之前還包括對(duì)細(xì)胞滴片進(jìn)行老化處理，并將老化處理 后的細(xì)胞滴片置于胰蛋白酶溶液中消化處理的步驟，再對(duì)消化處理后得到的細(xì)胞滴片進(jìn)行 所述染色處理，其中，染色處理使用的染色液為Giemsa染色液。6. 如權(quán)利要求1所述的相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法，其特征在于，在所述步驟S3 中，收集的易位染色體斷點(diǎn)附近的染色質(zhì)拷貝數(shù)量為6-8個(gè)； 所述步驟S3包括如下步驟： 步驟S31，將樣本置于顯微鏡下找到相互易位的染色體，并切割下易位染色體斷點(diǎn)附近 的染色質(zhì)； 步驟S32,將切割下的染色質(zhì)轉(zhuǎn)移入含有UNl引物的收集液中，進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增處理，所述 UNl引物的序列如SEQ ID No. 1所示； 步驟S33,對(duì)將預(yù)擴(kuò)增處理得到溶液置于含有UNl引物的擴(kuò)增液中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增處理。7. 如權(quán)利要求6所述的相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法，其特征在于，在所述步驟S32 中，所述收集液包括如下體積份數(shù)的各組分：I y L的5 X TOPO緩沖液、0. 5 y L的2mM dNTP、 0.1 y L的UNl引物、3. 5 y L的ClH2O以及0.1 y L的拓?fù)洚悩?gòu)酶I ; 在所述步驟S32中，預(yù)擴(kuò)增的條件為：先94 °C處理5min，然后按照94 °C lmin、 30°C l_5min、37°C 3min循環(huán)4-15次，其中，每個(gè)循環(huán)在30°C處理時(shí)均需向反應(yīng)體系中加入 0? 2 y L的T7DNA測(cè)序酶； 在所述步驟S33中，所述擴(kuò)增液包括如下體積分?jǐn)?shù)的各組分：5 y L的10 X PCR緩沖液、 5 y L 的 2mM dNTP、I y L 的 UNl 引物、40 y L 的 dH20 以及 2. 5U 的 Taq DNA 多聚酶； 在所述步驟S33中，所述PCR擴(kuò)增的條件為：先94°C處理5min，然后按照94°C lmin、 56°C lmin、72°C I. 5min 循環(huán) 30 次，再 72°C 5min，最后于 16°C保存。8. 如權(quán)利要求1所述的相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法，其特征在于，在所述步驟S3 之后，所述步驟S4之前，還包括對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PCR熒光標(biāo)記，并在有絲分裂中期核分裂相 中進(jìn)行FISH，以驗(yàn)證顯微切割是否成功的步驟。9. 如權(quán)利要求1所述的相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法，其特征在于，在所述步驟S4 中，包括構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)、對(duì)構(gòu)建的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行NGS測(cè)序以及對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的 步驟。10. 如權(quán)利要求1所述的相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法，其特征在于，在所述步驟S4 之后還包括： 在獲得的斷點(diǎn)位置附近設(shè)計(jì)引物，對(duì)樣本的gDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，獲取確切的斷點(diǎn)位置。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種相互易位染色體的斷點(diǎn)分析方法，其利用染色體顯微切割技術(shù)獲得易位染色體斷點(diǎn)附近染色質(zhì)，再利用NGS技術(shù)測(cè)序分析，可以快速且相對(duì)價(jià)廉地進(jìn)行斷點(diǎn)的精確定位，有利于對(duì)相互易位染色體進(jìn)行后續(xù)分析，如可以利用這些信息設(shè)計(jì)引物，對(duì)相互易位攜帶者的PGD胚胎進(jìn)行診斷，分辨完全正常胚胎和攜帶相互易位染色體的胚胎，通過(guò)僅移植完全正常的胚胎而阻斷相互易位染色體在該家族中的傳遞。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105039569
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510527239
【發(fā)明人】胡亮, 譚躍球, 馮濤, 楊凱, 程德華, 李自立, 何文斌, 林戈, 盧光琇
【申請(qǐng)人】湖南光琇高新生命科技有限公司, 北京嘉寶仁和醫(yī)療科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年8月25日