，或高于引物延伸反應 的占優(yōu)勢的循環(huán)所使用的Ta，例如比所述引物延伸反應的最高或占優(yōu)勢的Ta高小于或等 于15°C，例如高小于或等于10°C，例如比所述引物延伸反應的最高或占優(yōu)勢的Ta高1至 15°C，諸如高1至10°C。通常所述Ta可以在大約46和65°C之間，例如在50和60°C之間。
[0053] 在本發(fā)明中，標記的熒光盒寡核苷酸對（或所述引物寡核苷酸）的一個或二者可 以含有修飾的堿基，如硫代磷酸酯修飾的堿基。在任何給定的寡核苷酸/引物中被硫代磷 酸酯所取代的磷酸二酯鍵的數量范圍可以從無到所有的磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯所取代， 例如一個、兩個、三個、四個或更多個。所述寡核苷酸/引物可以在5'和/或3'末端含有 硫代磷酸酯，但是優(yōu)選的是，作為此類末端修飾的替代或除了此類末端修飾外，寡核苷酸/ 引物的至少一個內部堿基為硫代磷酸酯。例如所述堿基的10-90 %、20-80 %、30-70 %或 40-60%可以為硫代磷酸酯。在一個實施方案中，所述硫代磷酸酯修飾的堿基（其中有多于 一個）被至少一個（例如一個至三個）未修飾的（磷酸二酯）堿基所分開，例如在所述寡 核苷酸/引物內的替代堿基可以為硫代磷酸酯。在一個例子中，所述熒光（供體）標記的 熒光盒寡核苷酸或寡核苷酸含有硫代磷酸酯修飾的堿基可能是特別有用的。據認為，硫代 磷酸酯修飾的堿基的存在可有助于減少異常產物的形成，所述異常產物可以產生熒光并因 此導致產生錯誤的熒光信號。參見例如PCT/GB2012/050645,討論硫代磷酸酯摻入模式，其 也被認為相對于本發(fā)明是有用的。
[0054] 在本發(fā)明的方法中產生的信號可以通過測量在所述引物延伸反應過程中或之后 的任一點的信號來進行檢測。所述信號的測量可以是定性的或定量的。不認為有必要為了 能夠測量所述信號而必須專門適應所述反應的溫度。可以在所述引物延伸反應的正常過程 期間檢測所述信號。
[0055] 本發(fā)明可用于各種不同應用，并且特別適用于基于PCR的反應，以及用于包括SNP 檢測應用、等位基因變異檢測應用、基因表達研究、拷貝數變異研究、實時和終點PCR等的 應用。
[0056] 如上所示，本發(fā)明可用于模板依賴性引物延伸反應和用于確定引物延伸反應混合 物中引物延伸產物的產生，例如檢測引物延伸產物是否在引物延伸反應中產生。引物延伸 產物是指由模板依賴性引物延伸反應所得到的核酸分子。模板依賴性引物延伸反應是這樣 的反應，其中聚合酶延伸與模板核酸分子雜交的核酸引物分子，其中加到所述引物核酸分 子末端的堿基的序列由所述模板鏈中堿基的序列確定。模板依賴性引物延伸反應既包括擴 增又包括非擴增的引物延伸反應。在本發(fā)明的一些實施方案中，其中檢測到引物延伸產物 的產生的所述模板依賴性引物延伸反應是擴增反應，例如聚合酶鏈式反應（PCR)。
[0057] 可以使用本發(fā)明的方法鑒定的核酸靶標包括任何含有核酸的靶標，諸如天然DNA 或RNA。在適當的情況下所述核酸包括這樣的序列：所述序列包括DNA和RNA的任何已知 堿基類似物，諸如4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮丙?；奏?、假異胞嘧啶、 5_ (羧基羥甲基）尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧 甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧 啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2, 2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲 基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧 基氨甲基-2-硫尿啼啶、0-D-甘露糖辮苷（0-D_mannosylqueosine)、5'-甲氧基羰基甲 基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧 啶_5_氧乙酸、oxybutoxosine、假尿啼啶、辮苷（queosine)、2_硫胞啼啶、5-甲基-2-硫尿 嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧 乙酸、假尿嘧啶、辮苷、2-硫胞嘧啶和2, 6-二氨基嘌呤；或者它們可以含有PNA。
[0058] 盡管這不是通常情況，但是在本發(fā)明的方法中所使用的寡核苷酸可以適當地包括 這樣的堿基類似物或PNA。
[0059] 在實踐本發(fā)明的方法時，第一步是產生引物延伸混合物，例如包括發(fā)生引物延伸 反應所必需的所有元素的組合物。在一個例子中，所述引物延伸混合物通常包括至少一對 標記的寡核苷酸（所述盒寡核苷酸集）用于引物延伸反應，所述寡核苷酸互相雜交形成熒 光淬滅對，其中一個寡核苷酸用熒光部分進行標記并且另一個寡核苷酸用淬滅部分進行標 記，其中所述熒光淬滅對具有大于所述引物延伸反應的Ta的Tm(TmA)。每集的熒光標記的 寡核苷酸包含能夠與特定組的每個引物集的第一寡核苷酸引物（正向引物）的5'上游熒 光盒特異性區(qū)域的互補物雜交的序列。組中正向引物的每一個均具有（通常不同的）靶特 異性部分和（通常相同或密切相關的）5'上游熒光盒特異性部分。一旦引入（例如當特定 引物集的引物所指向的靶核酸存在時，通過所述引物延伸反應過程）所述5'上游熒光盒特 異性部分（所述熒光標記的熒光盒寡核苷酸能夠與其雜交）的互補序列，則產生可檢測的 信號，原因是受體（淬滅劑）標記的熒光盒寡核苷酸結合并淬滅來自熒光（供體）標記的 熒光盒寡核苷酸的信號的能力較低。隨著引物延伸反應進行并且熒光標記的熒光盒寡核苷 酸能夠雜交的延伸產物產生越多，一般產生的信號越強。
[0060] 因此，除了熒光團結構域外，熒光標記的寡核苷酸還包含能夠與給定組的第一寡 核苷酸引物（正向引物）的5'上游尾部分（熒光盒特異性部分）的互補物雜交的序列。該 "標簽"序列結合核酸序列（延伸產物），所述核酸序列作為反應中包含的標簽引物的互補 物而產生（其可以是未標記的，或者其可以例如在引物延伸反應的后續(xù)輪中為熒光標記的 盒寡核苷酸本身），例如在嚴謹雜交條件下，例如在引物延伸反應混合物中，溫度為Ta或高 于Ta，例如Tm溫度至少為Ta。
[0061] 如上所述，在特定組中的每一個第一寡核苷酸引物（正向引物）的熒光盒特異性 部分或"標簽"序列通?？梢允窍嗤幕蛎芮邢嚓P的，例如為相同的長度或長度差別小于大 約10個、更典型地5、4、3、2或1個核苷酸，并且在重疊區(qū)域互相具有至少大約80、85、90、更 典型地至少大約95、96、97、98、99或100%的同一性。例如，可以有不超過3、2或1個不相 同的核苷酸?？赡茏蠲鞔_的是這些熒光盒特異性部分是相同的，但這并不是必須的，這樣允 許在寡核苷酸設計中具有更多的靈活性。
[0062]對于本領域技術人員明顯的是，一個組的熒光盒特異性部分或標簽序列或序列通 常會與不同組的那些序列顯著不同，從而一個組的熒光盒特異性部分和另一個組的熒光盒 特異性部分的互補物之間實際上沒有相關雜交。
[0063]除了受體結構域之外，受體部分標記的盒寡核苷酸能夠與相應的熒光標記的盒寡 核苷酸雜交從而形成熒光淬滅對，其中所述熒光淬滅對具有TmA。
[0064]通常，熒光標記的盒寡核苷酸不包含靶序列特異性部分，即不包含與靶多核苷酸 雜交（在引物延伸反應的Ta下）的序列，其中第一寡核苷酸引物的靶特異性部分旨在與所 述靶多核苷酸雜交。因此，在這樣的安排下，所述熒光標記的盒寡核苷酸不依賴于特定的靶 序列但可以被用于（與合適的寡核苷酸引物集）檢測由任一靶序列產生的引物延伸產物。 熒光標記的盒寡核苷酸（和相應的受體/淬滅劑標記的盒寡核苷酸）可以被包含于"主 (master)"測定混合物中，與（靶特異性）"測定"混合物并排使用。通常，所述受體/供體 標記的盒寡核苷酸也不包含靶序列特異性部分。
[0065]通常，熒光標記的盒寡核苷酸由熒光部分（供體部分）和能夠與第一寡核苷酸引 物的熒光盒特異性部分的互補物雜交的序列組成。通常，所述受體/淬滅劑標記的盒寡核 苷酸由受體/淬滅劑部分和能夠與熒光標記的盒寡核苷酸的熒光盒特異性部分雜交的序 列組成。
[0066] 可以期望的是，熒光（供體）標記的熒光盒寡核苷酸和受體（淬滅劑）標記的熒 光盒寡核苷酸之間的相互作用的穩(wěn)定性低于熒光（供體）標記的熒光盒寡核苷酸和延伸產 物之間的相互作用的穩(wěn)定性，所述延伸產物與相關組的每個引物集的正向寡核苷酸引物的 5'上游熒光盒特異性部分互補。這樣的安排可能用于在避免產生異常信號和允許引物延伸 反應有效進行之間實現(xiàn)最佳平衡。因此，熒光（供體）標記的熒光盒寡核苷酸和受體（淬 滅劑）標記的熒光盒寡核苷酸之間的雜交的Tm可低于熒光（供體）標記的熒光盒寡核苷 酸和延伸產物之間的雜交的Tm、TmC(或多個Tm、多個TmC)，其中所述延伸產物與相關組 的每個引物集的正向寡核苷酸引物的5'上游熒光盒特異性部分互補。因此，引物延伸反應 的Ta低于熒光淬滅對的TmA，TmA可以低于TmC(例如低大約1至10°C，所述TmC即針 對在熒光標記的寡核苷酸和要形成的引物延伸產物之間的雜交）。
[0067]需要注意的是，對于每個引物集可以（但不需要）有不同的TmC，因此可具有與各 組（的引物集）相關的多個TmC以及與不同組相關的多個TmC。通常，與特定組（的多 個引物集）相關的TmC高于相關熒光盒集的TmA。通常，特定引物延伸反應中的所有Tm A高于該反應的Ta。通常，特定引物延伸反應的所有TmC會在彼此的大約10、更通常是5、 4、3、2或1°C內，通常，特定引物延伸反應的所有TmA會在彼此的大約10、更通常是5、4、3、 2或1°C內。
[0068] 在一個例子中（例如當熒光標記的盒寡核苷酸不包含靶特異性序列），淬滅劑標 記的盒寡核苷酸比熒光標記的盒寡核苷酸短1至5個核苷酸堿基。通常，熒光標記的盒寡 核苷酸的未配對（相對于淬滅劑標記的盒寡核苷酸）的部分位于熒光標記的盒寡核苷酸 的3'端或淬滅劑標記的盒寡核苷酸的5'端"對面"。通常，相關寡核苷酸引物（或多個引 物）的部分（其互補物與熒光標記的盒寡核苷酸雜交）是熒光標記的盒寡核苷酸長度的大 約5個核苷酸以內（例如比其短5、4、3、2或1個核苷酸以及長5、4、3、2或1個核苷酸，例 如相同長度），例如通常在寡核苷酸引物和熒光標記的盒寡核苷酸的5'端具有任意長度差 異。在隨后幾輪引物延伸反應中，熒光標記的盒寡核苷酸本身能夠作為引物，因此在引物延 伸過程中形成的互補物將通常延伸至熒光標記的盒寡核苷酸的5'端。因此，與淬滅劑標記 的盒寡核苷酸雜交的互補物的部分通常與淬滅劑標記的盒寡核苷酸一樣長。
[0069]在其它例子中，可選地或者除此之外，淬滅劑標記的盒寡核苷酸和熒光標記的盒 寡核苷酸之間的錯配比相關寡核苷酸引物（或多個引物）的互補物和熒光標記的盒寡核苷 酸之間的錯配多（或更顯著）。正如對于本領域技術人員眾所周知的是，錯配在寡核苷酸對 內的位置和錯配的性質（例如A:T配對是否破壞或者是G:C配對）會影響錯配對穩(wěn)定性的 改變/Tm的改變的重要性。
[0070]在又一些例子中，相對于在引物延伸反應混合物中所使用的那些，可選的或者額 外的不同核苷酸/堿基可用于淬滅劑標記的盒寡核苷酸（并因此被摻入引物互補物中），從 而改變所述淬滅劑標記的盒寡核苷酸和所述熒光標記的盒寡核苷酸和引物延伸產物之間 雜交的相對穩(wěn)定性。通常，對于本領域技術人員明顯的是，"非標準"堿基可以用于淬滅劑標 記的盒寡核苷酸，"標準"堿基可以用于引物延伸混合物，但是其它安排也是可能的。
[0071] 應當理解的是，在不同的安排中，如果熒光標記的盒寡核苷酸不僅包含"標簽"序 列，而且包含與要檢測的靶核酸互補的序列（參見后文所述的"直接"實施方案），那么與熒 光標記的盒寡核苷酸具有"標簽"序列但沒有與要檢測的靶核酸互補的序列的安排相比，熒 光標記的盒寡核苷酸和延伸產物之間存在更長的互補性區(qū)域。認為在這種安排下，來源于 被降低的熒光淬滅對的TmA的益處較少，因此，不認為提供了特定的益處給例如與受體標 記的盒寡核苷酸中的"標簽"對應的區(qū)域，所述區(qū)域與熒光團標記的盒寡核苷酸相比較短或 具有錯配或具有不同的堿基組成。值得注意的是，這種安排（下文被稱為"直接"安排）被 認為是潛在有用的，但是意味著至少不同的熒光/供體標記的寡核苷酸是每個要檢測的靶 序列通常所需要的，而在之前（"間接"）的安排中沒有靶特異性序列（例如能夠在引物延 伸反應的Ta下進行雜交），沒有必要針對每個要檢測的靶序列（其中可以有成百或成千的 可能性）合成不同的熒光/供體標記的寡核苷酸（或受體/淬滅劑標記的核苷酸）。在給 定的引物延伸反應中，針對在該特定引物延伸反應中要被分析的每個靶序列，需要不同的 熒光/供體標記的寡核苷酸（例如2、3、4或5,如下文所進一步討論的），但是同樣集合的 熒光盒寡核苷酸可能能夠與任一靶序列一起使用。
[0072] 根據寡核苷酸和測定本身的性質（例如是否使用"直接"或"間接"的安排），至 少熒光標記的盒寡核苷酸的"標簽"區(qū)域可以與引物延伸