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      聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)系統(tǒng)的制作方法_5

      文檔序號(hào):9332232閱讀:來源:國知局
      GTTAGGATGA
      [0159]FAM互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:AACCTAACGGCTAATCGCTCA/Dab/
      [0160]HEX熒光寡核苷酸:/HEX/GCTGGTCGGTGAACAGGTTAGAGA
      [0161]HEX互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:TAACCTGITCACCGACCAGC/Dab/
      [0162]盒對(duì) 2:
      [0163]FAM熒光寡核苷酸:/6FAM/TCAGTGAGCGATTAGCCGTTAGGATGA
      [0164] FAM互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:AACCTAACGGCTAATCGCTCACTGA/Dab
      [0165] HEX熒光寡核苷酸:/HEX/TACAGCTGGTCGGTGAACAGGTTAGAGA
      [0166] HEX互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:TAACCTGITCACCGACCAGCTGTA/Dab/
      [0167]盒對(duì)3:
      [0168] FAM熒光寡核苷酸:/6FAM/TGTCTCAGTGAGCGATTAGCCGITAGGATGA
      [0169] FAM互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:AACCTAACGGCTAATCGCTCACTGAGACA/Dab
      [0170] HEX熒光寡核苷酸:/5HEX/ATGCTACAGCTGGTCGGTGAACAGGITAGAGA
      [0171] HEX互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:TAACCTGITCACCGACCAGCTGTAGCAT/Dab/
      [0172]盒對(duì)4:
      [0173] FAM熒光寡核苷酸:/6FAM/ATGCTGTCTCAGTGAGCGAITAGCCGTTAGGATGA
      [0174] FAM互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:AACCTAACGGCTAATCGCTCACTGAGACAGCAT/Dab/
      [0175] HEX熒光寡核苷酸:/5HEX/AAGCATGCTACAGCTGGTCGGTGAACAGGTTAGAGA
      [0176] HEX互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:TAACCTGITCACCGACCAGCTGTAGCATGCIT/Dab/
      [0177]盒對(duì)5:
      [0178] FAM熒光寡核苷酸:/6FAM/G*CG*AT*TA*GC*CG*TT*AG*GA*TG*A
      [0179] FAM互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:CCTAACGGCTAATCGC/Dab/
      [0180] HEX熒光寡核苷酸:/5HEX/G*TC*GG*TG*AA*CA*GG*TT*AG*AG*A
      [0181] HEX互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:5'AACCTGITCACCGAC/Dab/
      [0182] 摻入到熒光團(tuán)/淬滅劑盒的硫代磷酸酯描述于專利申請(qǐng)PCT/GB2012/050645中。 除了列出的那些,還可以使用盒5的許多變體。能夠選擇用于代替所列的那些的序列變體 是:
      [0183] 1)/6FAM/GCGATTAGCCGTTAGGATGA
      [0184] 2)/6FAM/GCGATTAGCCGTTAGGATG*A
      [0185] 3)/6FAM/G*C*G*A*T*T*A*G*C*C*G*T*T*AG*G*A*T*G*A
      [0186] 4)/HEX/GTCGGTGAACAGGTTAGAGA
      [0187] 5)/HEX/GTCGGTGAACAGGTTAGAG*A
      [0188] 6)/5HEX/*G*T*C*G*G*T*G*A*A*C*A*G*G*T*T*A*G*A*G*A
      [0189] 7)C*CT*AA*CG*GC*TA*AT*CG*C/3Dab/
      [0190] 8)CC*TA*AC*GG*CT*AA*TC*GC/3Dab/
      [0191] 9)C*C*T*A*A*C*G*G*C*T*A*A*T*C*G*C/3Dab/
      [0192] 10)AA*CC*TG*TT*CA*CC*GA*/3Dab/
      [0193] 11)A*AC*CT*GT*TC*AC*CG*AC/3Dab/
      [0194] 12)A*A*OC*T*G*T*T*OA*OOG*A*C/3Dab/
      [0195] 實(shí)施例1 :確宙熒光閉/淬滅劑盒的熔解淵度
      [0196] 實(shí)驗(yàn)確定所述熒光團(tuán)/淬滅劑盒的熔解溫度。盒1-5被摻入含有以下最終濃度的 成分的反應(yīng)混合物:
      [0197] 1) 0.luMFAM-標(biāo)記的寡核苷酸
      [0198] 2) 0.luMHEX-標(biāo)記的寡核苷酸
      [0199] 3) 0? 5uM淬滅劑標(biāo)記的寡核苷酸(對(duì)FAM標(biāo)記的寡核苷酸為反義)
      [0200] 4)0.5uM淬滅劑標(biāo)記的寡核苷酸(對(duì)HEX標(biāo)記的寡核苷酸為反義)
      [0201] 5)8. 5mMTris/HClpH8. 3
      [0202] 6)42. 5mMKC1
      [0203] 7)1.8mM氯化鎂
      [0204] 8) 165. 2uMdNTPs
      [0205] 9) 212. 5nM5-羧基-X-羅丹明,SE(5-R0X,SE)
      [0206] 10)0. 04%Igepal
      [0207] 在不存在DNA聚合酶的情況下確定每個(gè)盒的恪解溫度。在RocheLightCycler 480設(shè)備上在96孔白板上使用每孔10ul的反應(yīng)混合物,進(jìn)行每個(gè)熒光團(tuán)/淬滅劑盒的熔解 曲線分析。
      [0208] 通過加熱混合物至95°°C30秒來進(jìn)行熔解曲線分析。以0. 06°C/秒的速度從 40-95度進(jìn)行恪解曲線分析。對(duì)于每個(gè)盒測(cè)試六個(gè)重復(fù)。通過LightCycler480分析函數(shù) (-dF/dt)從熔解曲線數(shù)據(jù)產(chǎn)生熔解峰。通過使用手動(dòng)Tm選項(xiàng)以鑒別反向熔解峰中的最低 點(diǎn),來計(jì)算Tm(這是必須的,原因是使用該軟件不能在反向峰中進(jìn)行Tm的自動(dòng)計(jì)算)。實(shí)驗(yàn) 確定的每個(gè)熒光團(tuán)/淬滅劑盒的Tm列舉如下:
      [0209]FAM標(biāo)記的熒光核苷酸和相應(yīng)的淬滅劑:
      [0210]
      [0211] HEX標(biāo)記的熒光核苷酸和相應(yīng)的淬滅劑:
      [0212]
      [0213]實(shí)施例2--熒光1的終點(diǎn)檢測(cè)
      [0214] 在盒1和盒5之間進(jìn)行直接比較。盒1具有實(shí)驗(yàn)確定的高于用于該擴(kuò)增反應(yīng)的退 火溫度的Tm。盒5具有實(shí)驗(yàn)確定的低于所述擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度的Tm(參見實(shí)施例1)。
      [0215] 所有寡核苷酸冷凍干燥購買并重懸于10mMTris/HClpH8. 0中至200yM的初始 濃度。在該稀釋劑中進(jìn)行所有進(jìn)一步的稀釋。
      [0216] 在384孔黑板中以4y1反應(yīng)體積進(jìn)行擴(kuò)增。lx反應(yīng)混合物(mix)含有以下成分:
      [0217] 1)0. 16uM等位基因特異性引物1
      [0218]2)0. 16uM等位基因特異性引物2
      [0219] 3)0. 41uM反向(通用)引物
      [0220] 4) 0.luMFAM-標(biāo)記的寡核苷酸
      [0221] 5) 0.luMHEX-標(biāo)記的寡核苷酸
      [0222] 6) 0? 5uM淬滅劑標(biāo)記的寡核苷酸(對(duì)FAM標(biāo)記的寡核苷酸為反義)
      [0223] 7) 0? 5uM淬滅劑標(biāo)記的寡核苷酸(對(duì)HEX標(biāo)記的寡核苷酸為反義)
      [0224] 8)8. 5mMTris/HClpH8. 3
      [0225] 9)42. 5mMKC1
      [0226] 10)1.8mM氯化鎂
      [0227] 11) 165. 2uMdNTPs
      [0228] 12) 212. 5nM5-羧基-X-羅丹明,SE(5-R0X,SE)
      [0229] 13)0. 04%Igepal
      [0230] 除了所列的成分外,每個(gè)混合物應(yīng)當(dāng)含有2-50y1/ml沒有外切酶活性的N-末端 截短的聚合酶。所述酶沒有外切酶活性不是必需的,但是優(yōu)選的,特別是用于SNP分析。
      [0231] 所使用的測(cè)定特異性引物是:
      [0232] 等位基因特異性引物1 :
      [0233] 5'GCGATTAGCCGTTAGGATGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAAT3,
      [0234] 等位基因特異性引物2:
      [0235] 5'GTCGGTGAACAGGTTAGAGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAAA3'
      [0236]通用反向引物:5'CACTCTAGTACTATATCTGTCACATGGTA3'
      [0237] 將硫代磷酸酯加入寡核苷酸被描述于專利申請(qǐng)PCT/GB2012/050645中。還可以使 用硫代磷酸酯標(biāo)記的測(cè)定引物。針對(duì)以上列出的那些能夠被取代的可選引物的例子是:
      [0238] 1) 5 'GCGATTAGCCGTTAGGATGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAA*T3 '
      [0239] 2) 5 'GTCGGTGAACAGGTTAGAGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAA*A3 '
      [0240] 3) 5'G*CG*AT*TA*GC*CG*TT*AG*GA*TG*AT*GA*AG*CT*COAOAA*TT*TG*GT*GA*AT* TA*TOAA*T3'
      [0241] 4) 5 'G*TC*GG*TG*AA*CA*GG*TT*AG*AG*AT*GA*AG*CT*COAOAA*TT*TG*GT*GA*AT* TA*TOAA*A3'
      [0242] 5) 5 'CA*CT*CT*AG*TA*CT*AT*AT*CT*GT*CA*CA*TG*GT*A3 '
      [0243] 6) 5 'G*C*G*A*T*T*A*G*C*C*G*T*T*A*G*G*A*T*G*A*A*T*G*A*A*G*C*T*C*C*A*C*A
      [0244] 7) 5'G*T*C*G*G*T*G*A*A*C*A*G*G*T*T*A*G*A*G*A*T*G*A*A*G*C*T*C*C*A*C*A*A
      [0245] 8) 5'C*A*C*T*C*T*A*G*T*A*C*T*A*T*A*T*C*T*G*T*C*A*C*A*T*G*G*T*A3'
      [0246] 在基于水浴的HydrocyclerPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為:
      [0247]94°C15分鐘(熱啟動(dòng)激活)
      [0248]60個(gè)循環(huán)的:
      [0249]94°C20秒
      [0250]57°C60秒(即57°C的Ta)
      [0251] 在反應(yīng)完全后在BMGPherastar熒光孔板分析儀上在室溫下讀取終點(diǎn)熒光。
      [0252] 圖2提供了使用上述引物對(duì)能夠產(chǎn)生的三個(gè)等位基因各自的實(shí)施例數(shù)據(jù)。該圖還 顯示了無模板對(duì)照(NTC)樣品(圓圈)相對(duì)于三個(gè)基因型簇的每一個(gè)的位置。在所示實(shí)施 例中,來自其中Tm低于擴(kuò)增反應(yīng)的Ta的反應(yīng)(左圖)的NTC明顯互相不同并提供了非特 異性擴(kuò)增的證據(jù)。盒1的實(shí)施例數(shù)據(jù)(右圖),其中Tm高于擴(kuò)增反應(yīng)的Ta,顯示在該反應(yīng) 中的NTC保持緊密簇集,熒光低于適當(dāng)擴(kuò)增的樣品簇的熒光。這表明沒有產(chǎn)生非特異性產(chǎn) 物。
      [0253]實(shí)施例3--熒光2的終點(diǎn)檢測(cè)
      [0254] 在盒1和盒5之間進(jìn)行直接比較。盒1具有實(shí)驗(yàn)確定的高于該擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫 度的Tm。盒5具有實(shí)驗(yàn)確定的低于所述擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度的Tm(參見實(shí)施例1)。
      [0255] 所有寡核苷酸冷凍干燥購買并重懸于10mMTris/HClpH8. 0中至200yM的初始 濃度。在該稀釋劑中進(jìn)行所有進(jìn)一步的稀釋。
      [0256] 在384孔黑板中以4y1反應(yīng)體積進(jìn)行擴(kuò)增。lx反應(yīng)混合物含有以下成分:
      [0257] 1)0. 16uM等位基因特異性引物1
      [0258] 2)0. 16uM等位基因特異性引物2
      [0259] 3)0. 41uM反向(通用)引物
      [0260] 4)0. luMFAM-標(biāo)記的寡核苷酸
      [0261] 5) 0. luMHEX-標(biāo)記的寡核苷酸
      [0262] 6) 0? 5uM淬滅劑標(biāo)記的寡核苷酸(對(duì)FAM標(biāo)記的寡核苷酸為反義)
      [0263] 7) 0? 5uM淬滅劑標(biāo)記的寡核苷酸(對(duì)HEX標(biāo)記的寡核苷酸為反義)
      [0264] 8) 10mMTris/HClpH 8. 3
      [0265] 9) 10mMKC1
      [0266]10)1.8mM氯化鎂
      [0267] 11) 165. 2uMdNTPs
      [0268] 12) 212. 5nM5-羧基-X-羅丹明,SE(5-ROX,SE)
      [0269
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