GTTAGGATGA
[0159]FAM互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:AACCTAACGGCTAATCGCTCA/Dab/
[0160]HEX熒光寡核苷酸:/HEX/GCTGGTCGGTGAACAGGTTAGAGA
[0161]HEX互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:TAACCTGITCACCGACCAGC/Dab/
[0162]盒對(duì) 2:
[0163]FAM熒光寡核苷酸:/6FAM/TCAGTGAGCGATTAGCCGTTAGGATGA
[0164] FAM互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:AACCTAACGGCTAATCGCTCACTGA/Dab
[0165] HEX熒光寡核苷酸:/HEX/TACAGCTGGTCGGTGAACAGGTTAGAGA
[0166] HEX互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:TAACCTGITCACCGACCAGCTGTA/Dab/
[0167]盒對(duì)3:
[0168] FAM熒光寡核苷酸:/6FAM/TGTCTCAGTGAGCGATTAGCCGITAGGATGA
[0169] FAM互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:AACCTAACGGCTAATCGCTCACTGAGACA/Dab
[0170] HEX熒光寡核苷酸:/5HEX/ATGCTACAGCTGGTCGGTGAACAGGITAGAGA
[0171] HEX互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:TAACCTGITCACCGACCAGCTGTAGCAT/Dab/
[0172]盒對(duì)4:
[0173] FAM熒光寡核苷酸:/6FAM/ATGCTGTCTCAGTGAGCGAITAGCCGTTAGGATGA
[0174] FAM互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:AACCTAACGGCTAATCGCTCACTGAGACAGCAT/Dab/
[0175] HEX熒光寡核苷酸:/5HEX/AAGCATGCTACAGCTGGTCGGTGAACAGGTTAGAGA
[0176] HEX互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:TAACCTGITCACCGACCAGCTGTAGCATGCIT/Dab/
[0177]盒對(duì)5:
[0178] FAM熒光寡核苷酸:/6FAM/G*CG*AT*TA*GC*CG*TT*AG*GA*TG*A
[0179] FAM互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:CCTAACGGCTAATCGC/Dab/
[0180] HEX熒光寡核苷酸:/5HEX/G*TC*GG*TG*AA*CA*GG*TT*AG*AG*A
[0181] HEX互補(bǔ)淬滅寡核苷酸:5'AACCTGITCACCGAC/Dab/
[0182] 摻入到熒光團(tuán)/淬滅劑盒的硫代磷酸酯描述于專利申請(qǐng)PCT/GB2012/050645中。 除了列出的那些,還可以使用盒5的許多變體。能夠選擇用于代替所列的那些的序列變體 是:
[0183] 1)/6FAM/GCGATTAGCCGTTAGGATGA
[0184] 2)/6FAM/GCGATTAGCCGTTAGGATG*A
[0185] 3)/6FAM/G*C*G*A*T*T*A*G*C*C*G*T*T*AG*G*A*T*G*A
[0186] 4)/HEX/GTCGGTGAACAGGTTAGAGA
[0187] 5)/HEX/GTCGGTGAACAGGTTAGAG*A
[0188] 6)/5HEX/*G*T*C*G*G*T*G*A*A*C*A*G*G*T*T*A*G*A*G*A
[0189] 7)C*CT*AA*CG*GC*TA*AT*CG*C/3Dab/
[0190] 8)CC*TA*AC*GG*CT*AA*TC*GC/3Dab/
[0191] 9)C*C*T*A*A*C*G*G*C*T*A*A*T*C*G*C/3Dab/
[0192] 10)AA*CC*TG*TT*CA*CC*GA*/3Dab/
[0193] 11)A*AC*CT*GT*TC*AC*CG*AC/3Dab/
[0194] 12)A*A*OC*T*G*T*T*OA*OOG*A*C/3Dab/
[0195] 實(shí)施例1 :確宙熒光閉/淬滅劑盒的熔解淵度
[0196] 實(shí)驗(yàn)確定所述熒光團(tuán)/淬滅劑盒的熔解溫度。盒1-5被摻入含有以下最終濃度的 成分的反應(yīng)混合物:
[0197] 1) 0.luMFAM-標(biāo)記的寡核苷酸
[0198] 2) 0.luMHEX-標(biāo)記的寡核苷酸
[0199] 3) 0? 5uM淬滅劑標(biāo)記的寡核苷酸(對(duì)FAM標(biāo)記的寡核苷酸為反義)
[0200] 4)0.5uM淬滅劑標(biāo)記的寡核苷酸(對(duì)HEX標(biāo)記的寡核苷酸為反義)
[0201] 5)8. 5mMTris/HClpH8. 3
[0202] 6)42. 5mMKC1
[0203] 7)1.8mM氯化鎂
[0204] 8) 165. 2uMdNTPs
[0205] 9) 212. 5nM5-羧基-X-羅丹明,SE(5-R0X,SE)
[0206] 10)0. 04%Igepal
[0207] 在不存在DNA聚合酶的情況下確定每個(gè)盒的恪解溫度。在RocheLightCycler 480設(shè)備上在96孔白板上使用每孔10ul的反應(yīng)混合物,進(jìn)行每個(gè)熒光團(tuán)/淬滅劑盒的熔解 曲線分析。
[0208] 通過加熱混合物至95°°C30秒來進(jìn)行熔解曲線分析。以0. 06°C/秒的速度從 40-95度進(jìn)行恪解曲線分析。對(duì)于每個(gè)盒測(cè)試六個(gè)重復(fù)。通過LightCycler480分析函數(shù) (-dF/dt)從熔解曲線數(shù)據(jù)產(chǎn)生熔解峰。通過使用手動(dòng)Tm選項(xiàng)以鑒別反向熔解峰中的最低 點(diǎn),來計(jì)算Tm(這是必須的,原因是使用該軟件不能在反向峰中進(jìn)行Tm的自動(dòng)計(jì)算)。實(shí)驗(yàn) 確定的每個(gè)熒光團(tuán)/淬滅劑盒的Tm列舉如下:
[0209]FAM標(biāo)記的熒光核苷酸和相應(yīng)的淬滅劑:
[0210]
[0211] HEX標(biāo)記的熒光核苷酸和相應(yīng)的淬滅劑:
[0212]
[0213]實(shí)施例2--熒光1的終點(diǎn)檢測(cè)
[0214] 在盒1和盒5之間進(jìn)行直接比較。盒1具有實(shí)驗(yàn)確定的高于用于該擴(kuò)增反應(yīng)的退 火溫度的Tm。盒5具有實(shí)驗(yàn)確定的低于所述擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度的Tm(參見實(shí)施例1)。
[0215] 所有寡核苷酸冷凍干燥購買并重懸于10mMTris/HClpH8. 0中至200yM的初始 濃度。在該稀釋劑中進(jìn)行所有進(jìn)一步的稀釋。
[0216] 在384孔黑板中以4y1反應(yīng)體積進(jìn)行擴(kuò)增。lx反應(yīng)混合物(mix)含有以下成分:
[0217] 1)0. 16uM等位基因特異性引物1
[0218]2)0. 16uM等位基因特異性引物2
[0219] 3)0. 41uM反向(通用)引物
[0220] 4) 0.luMFAM-標(biāo)記的寡核苷酸
[0221] 5) 0.luMHEX-標(biāo)記的寡核苷酸
[0222] 6) 0? 5uM淬滅劑標(biāo)記的寡核苷酸(對(duì)FAM標(biāo)記的寡核苷酸為反義)
[0223] 7) 0? 5uM淬滅劑標(biāo)記的寡核苷酸(對(duì)HEX標(biāo)記的寡核苷酸為反義)
[0224] 8)8. 5mMTris/HClpH8. 3
[0225] 9)42. 5mMKC1
[0226] 10)1.8mM氯化鎂
[0227] 11) 165. 2uMdNTPs
[0228] 12) 212. 5nM5-羧基-X-羅丹明,SE(5-R0X,SE)
[0229] 13)0. 04%Igepal
[0230] 除了所列的成分外,每個(gè)混合物應(yīng)當(dāng)含有2-50y1/ml沒有外切酶活性的N-末端 截短的聚合酶。所述酶沒有外切酶活性不是必需的,但是優(yōu)選的,特別是用于SNP分析。
[0231] 所使用的測(cè)定特異性引物是:
[0232] 等位基因特異性引物1 :
[0233] 5'GCGATTAGCCGTTAGGATGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAAT3,
[0234] 等位基因特異性引物2:
[0235] 5'GTCGGTGAACAGGTTAGAGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAAA3'
[0236]通用反向引物:5'CACTCTAGTACTATATCTGTCACATGGTA3'
[0237] 將硫代磷酸酯加入寡核苷酸被描述于專利申請(qǐng)PCT/GB2012/050645中。還可以使 用硫代磷酸酯標(biāo)記的測(cè)定引物。針對(duì)以上列出的那些能夠被取代的可選引物的例子是:
[0238] 1) 5 'GCGATTAGCCGTTAGGATGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAA*T3 '
[0239] 2) 5 'GTCGGTGAACAGGTTAGAGATGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAA*A3 '
[0240] 3) 5'G*CG*AT*TA*GC*CG*TT*AG*GA*TG*AT*GA*AG*CT*COAOAA*TT*TG*GT*GA*AT* TA*TOAA*T3'
[0241] 4) 5 'G*TC*GG*TG*AA*CA*GG*TT*AG*AG*AT*GA*AG*CT*COAOAA*TT*TG*GT*GA*AT* TA*TOAA*A3'
[0242] 5) 5 'CA*CT*CT*AG*TA*CT*AT*AT*CT*GT*CA*CA*TG*GT*A3 '
[0243] 6) 5 'G*C*G*A*T*T*A*G*C*C*G*T*T*A*G*G*A*T*G*A*A*T*G*A*A*G*C*T*C*C*A*C*A
[0244] 7) 5'G*T*C*G*G*T*G*A*A*C*A*G*G*T*T*A*G*A*G*A*T*G*A*A*G*C*T*C*C*A*C*A*A
[0245] 8) 5'C*A*C*T*C*T*A*G*T*A*C*T*A*T*A*T*C*T*G*T*C*A*C*A*T*G*G*T*A3'
[0246] 在基于水浴的HydrocyclerPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為:
[0247]94°C15分鐘(熱啟動(dòng)激活)
[0248]60個(gè)循環(huán)的:
[0249]94°C20秒
[0250]57°C60秒(即57°C的Ta)
[0251] 在反應(yīng)完全后在BMGPherastar熒光孔板分析儀上在室溫下讀取終點(diǎn)熒光。
[0252] 圖2提供了使用上述引物對(duì)能夠產(chǎn)生的三個(gè)等位基因各自的實(shí)施例數(shù)據(jù)。該圖還 顯示了無模板對(duì)照(NTC)樣品(圓圈)相對(duì)于三個(gè)基因型簇的每一個(gè)的位置。在所示實(shí)施 例中,來自其中Tm低于擴(kuò)增反應(yīng)的Ta的反應(yīng)(左圖)的NTC明顯互相不同并提供了非特 異性擴(kuò)增的證據(jù)。盒1的實(shí)施例數(shù)據(jù)(右圖),其中Tm高于擴(kuò)增反應(yīng)的Ta,顯示在該反應(yīng) 中的NTC保持緊密簇集,熒光低于適當(dāng)擴(kuò)增的樣品簇的熒光。這表明沒有產(chǎn)生非特異性產(chǎn) 物。
[0253]實(shí)施例3--熒光2的終點(diǎn)檢測(cè)
[0254] 在盒1和盒5之間進(jìn)行直接比較。盒1具有實(shí)驗(yàn)確定的高于該擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫 度的Tm。盒5具有實(shí)驗(yàn)確定的低于所述擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度的Tm(參見實(shí)施例1)。
[0255] 所有寡核苷酸冷凍干燥購買并重懸于10mMTris/HClpH8. 0中至200yM的初始 濃度。在該稀釋劑中進(jìn)行所有進(jìn)一步的稀釋。
[0256] 在384孔黑板中以4y1反應(yīng)體積進(jìn)行擴(kuò)增。lx反應(yīng)混合物含有以下成分:
[0257] 1)0. 16uM等位基因特異性引物1
[0258] 2)0. 16uM等位基因特異性引物2
[0259] 3)0. 41uM反向(通用)引物
[0260] 4)0. luMFAM-標(biāo)記的寡核苷酸
[0261] 5) 0. luMHEX-標(biāo)記的寡核苷酸
[0262] 6) 0? 5uM淬滅劑標(biāo)記的寡核苷酸(對(duì)FAM標(biāo)記的寡核苷酸為反義)
[0263] 7) 0? 5uM淬滅劑標(biāo)記的寡核苷酸(對(duì)HEX標(biāo)記的寡核苷酸為反義)
[0264] 8) 10mMTris/HClpH 8. 3
[0265] 9) 10mMKC1
[0266]10)1.8mM氯化鎂
[0267] 11) 165. 2uMdNTPs
[0268] 12) 212. 5nM5-羧基-X-羅丹明,SE(5-ROX,SE)
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