物用MeOH研磨得到棕色固體狀3- (9H-嘌呤-6-基氨基）-環(huán)己烷甲酸3-氯-芐基酰胺 (0? 12g, 11% )。LC/MS:m/z C19H21C1N60([M+H]+)計(jì)算值：385 ;實(shí)測值：385. 0。
[0253] 實(shí)施例3:
[0254] N*6*_ 環(huán)己基-N*2*-(l-甲基-1H-吡唑-4-基）-9H-嘌呤-2, 6-二胺
[0255]
[0256] 步驟1) (2-氯-9H-嘌呤-6-基）-環(huán)己基-胺
[0257]
[0258]向 2, 6-二氯-9H-嘌 kww丨明，l u丨丨，丨w丨、u gs乂、289mg, 2. 91mmol)的 DMF(5mL)溶液中加入DIPEA(0. 49mL, 2. 91mmol)并在氮?dú)夥障录訜嶂?00°C加熱16小時(shí)。 將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并加入水。濾出沉淀的固體，干燥得到黃色固體狀（2-氯-9H-嘌 呤-6-基）-環(huán)己基-胺（600mg，90. 1% )。LC/MS:m/z CnH14ClN5([M+H]+)計(jì)算值：252 ;實(shí) 測值：252。
[0259]步驟 2)N*6*_ 環(huán)己基-N*2*-(l-甲基-1H-吡唑-4-基）-9H-嘌呤-2, 6-二胺
[0260]
[0261]向（2-氯-9H-嘌呤-6-基）-環(huán)己基-胺（300mg, 1. 19mmol)的 n-Bu0H(2. OmL)溶 液中加入 1-甲基-1H-吡唑-4-基胺（810mg, 8. 34mmol)和 TMS-C1 (0? 567mL, 4. 65mmol)。將 反應(yīng)混合物在微波中于160°C照射1小時(shí)。減壓除去溶劑。將粗品物質(zhì)通過制備型HPLC純 化[柱 =Gemini NX C18(100x30.0mm)5ii，5mM NH40Ac/乙臆]得到灰白色固體狀N*6*_環(huán) 己基-N*2*-(l-甲基-1H-吡唑-4-基）-9H-嘌呤-2,6-二胺（60mg, 16% )。LC/MS:m/z C15H2QNS([M+H] +)計(jì)算值：313 ;實(shí)測值：313. 2。
[0262] 實(shí)施例4:
[0263] 腫6*-(3-甲基-環(huán)己基）-陋2*-(1-甲基-111-吡唑-4-基）-911-嘌呤-2,6-二胺
[0264]
[0265] 步驟1) (2-氯-9H-嘌呤-6-基）-(3-甲基-環(huán)己基）-胺
[0266]
[0267]向 2, 6_ 二氣-9H-噪吟（500mg, 2. 6mmol)和 3-甲基-環(huán)己基胺（329mg, 2. 91 mmol) 的DMF(5mL)溶液中加入DIPEA(0. 49mL，2. 91mmol)并在氮?dú)夥障录訜嶂?00 °C加 熱16小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并加入水。濾出沉淀的固體，干燥得到黃色固 體狀（2-氯-9H-嘌呤-6-基）-(3_ 甲基-環(huán)己基）-胺（600mg，86 % )。LC/MS:m/z C12H16C1N5([M+H] +)計(jì)算值：266 ;實(shí)測值：266. 3。
[0268] 步驟2) N*6*_ (3-甲基-環(huán)己基）-N*2*_ (1-甲基-1H-吡唑-4-基）-9H-嘌 呤-2, 6-二胺
[0269]
[0270]向（2-氯-9H-嘌呤-6-基）-(3_ 甲基-環(huán)己基）-胺（200mg，0?755mmol) 的n-Bu0H(2. OmL)溶液中加入1-甲基-1H-吡唑-4-基胺（513mg，5. 3mmol)和 TMS-C1 (0. 36mL，2. 94mmol)。將反應(yīng)混合物在微波中于160°C加熱1小時(shí)。減壓除去溶劑。 將粗品物質(zhì)通過制備型HPLC純化[柱=Gemini NX C18 (100x30.0 mm) 5 y，5mM NH40Ac/乙 腈]得到灰白色固體狀N*6*-(3-甲基-環(huán)己基）-N*2*-(l-甲基-1H-吡唑-4-基）-9H-嘌 呤-2, 6-二胺（65mg，27% )。LC/MS:m/z C16H22NS([M+H]+)計(jì)算值：327 ;實(shí)測值：327. 2。
[0271] 實(shí)施例5:
[0272] 4-叔丁基-N-{3-[2_(l-甲基-1H-吡唑-4-基氨基）-9H_嘌呤-6-基氨基]-環(huán) 己基}-苯甲酰胺
[0273]
[0274] 步驟1) [3-(2-氯-9H-嘌呤-6-基氨基）_環(huán)己基]-氨基甲酸叔丁酯
[0275]
[0276] 向2, 6-二氯-9H-噪呤（1. 5g, 7. 93mmol)和（3-氨基-環(huán)己基）-氨基甲酸叔丁 酯（1. 88g, 8. 73mmol)的 DMF(15mL)溶液中加入 DIPEA(1. 49mL, 8. 73mmol)并加熱至 110°C 加熱16小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并加入水。濾出沉淀的固體，干燥得到棕色固體狀 [3-(2_氯-9H-嘌呤-6-基氨基）-環(huán)己基]-氨基甲酸叔丁酯（1.8g，粗品）。LC/MS:m/z C 16H23C1N602([M+H]+)計(jì)算值：367 ;實(shí)測值：367. 2。
[0277] 步驟2)N-(2_氣-9H-噪吟_6_基）-環(huán)己燒_1，3_二胺TFA鹽
[0278]
[0279] 向攪拌著的[3_(2_氯-9H-嘌呤-6-基氨基）_環(huán)己基]-氨基甲酸叔丁酯粗 品（900mg, 2. 45mmol)的 DCM(5mL)溶液中于 0 °C 滴加 33 % TFA 的 DCM 溶液（10mL)并于 室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓除去溶劑。將粗品物質(zhì)用乙醚洗滌（2x 5mL)得到黑色粘性固體 狀的 N-(2-氯-9H-嘌呤-6-基）-環(huán)己烷-1，3-二胺 TFA 鹽（1. 95g,粗品）。LC/MS:m/z CnH15ClN6([M+H] +)計(jì)算值：267 ;實(shí)測值：267. 2。
[0280] 步驟3)4-叔丁基-N-[3_(2-氯-9H-嘌呤-6-基氨基）_環(huán)己基]-苯甲酰胺
[0281]
[0282]向 N- (2-氯-9H-嘌呤-6-基）-環(huán)己烷-1，3-二胺 TFA 鹽（1. 9g，5. Ommol)的 DMF(20mL)溶液中加入DIPEA(2. 65mL，15. Ommol)。將反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?5分鐘然后加 入HATU(2. 28g，6. Ommol)和4-叔丁基-苯甲酸（0. 89g，5. Ommol)。將反應(yīng)混合物室溫?cái)?拌16小時(shí)。將反應(yīng)混合物用水稀釋（40mL)并用Et0AC(2x60mL)萃取。將合并的有機(jī)層 用無水硫酸鈉干燥并減壓除去溶劑。將粗品物質(zhì)用己烷（40mL)洗滌并干燥得到棕色固體 狀4-叔丁基-N-[3-(2-氯-9H-嘌呤-6-基氨基）-環(huán)己基]-苯甲酰胺（800mg，3步的收 率 47% )。LC/MS:m/z C22H27C1N60([M+H]+)計(jì)算值：427 ;實(shí)測值：427. 2。步驟 4)4-叔丁 基-N-{3-[2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基氨基）-9H-嘌呤-6-基氨基]-環(huán)己基}-苯甲酰胺
[0283]
[0284] 向4-叔丁基-N-[3_(2-氯-9H-嘌呤-6-基氨基）_環(huán)己基]-苯甲酰 胺（200mg, 0? 46mmol)的n-Bu0H(2. OmL)溶液中加入1-甲基-1H-吡唑-4-基胺 (319mg, 3. 28mmol)和 TMS-C1 (0? 23mL, 21. 83mmol) 〇 將反應(yīng)混合物在微波中于 16(TC 照 射1小時(shí)。減壓除去溶劑。將粗品物質(zhì)通過制備型HPLC純化[柱=Gemini NX 110A C18(100x30. 0mm)5y，5mM NH40Ac/乙腈]得到灰白色固體狀 4-叔丁基-N-{3-[2-(l-甲 基-1H-吡唑-4-基氨基）-9H-嘌呤-6-基氨基]-環(huán)己基}-苯甲酰胺（52mg，22 % )。LC/ MS:m/z C26H33N90([M+H]+)計(jì)算值：488 ;實(shí)測值：488. 2。
[0285] 牛物學(xué)實(shí)施例
[0286] 布魯頓氏酪氨酸激酶（BTK)抑制試驗(yàn)
[0287] 該試驗(yàn)是通過過濾捕獲放射性的33P磷酸化產(chǎn)物。BTK、生物素化的SHJ太底物（Src 同源性）和ATP的相互作用導(dǎo)致肽底物的磷酸化。生物素化的產(chǎn)物是結(jié)合的鏈霉抗生素蛋 白瓊脂糖小珠。所有被結(jié)合的放射性標(biāo)記的產(chǎn)物都是用閃爍計(jì)數(shù)器來進(jìn)行探測的。
[0288] 試驗(yàn)板是96-孔聚丙?。℅reiner)和96-孔1. 2 y m親水性PVDF濾板 (Millipore)。這里所報(bào)告的濃度是最終的試驗(yàn)濃度：10-100 y M化合物的DMS0溶 液（Burdick和Jackson)、5-10nM BTK酶（His-標(biāo)記的，全長型）、30yM肽底物（生物 素-Aca-AAAEEnGEI-NH2)、100 y M ATP (Sigma)、8mM 咪唑（Sigma, pH 7. 2)、8mM 甘油-2-磷 酸酯（Sigma)、200iiM EGTA(Roche Diagnostics)、lmM MnCl2(Sigma)、20mM MgCl2(Sigma)、 0.1mg/ml BSA(Sigma)、2mM DTT(Sigma)、liiCi 33P ATP(Amersham)、20% 鏈霉抗生素蛋 白瓊脂糖小珠（Amersham)、50mM EDTA(Gibco)、2M NaCl (Gibco)、2M NaCl w/1 % 磷酸 (Gibco)、microscint-20(Perkin Elmer)〇
[0289] IC5。測定是利用由標(biāo)準(zhǔn)96-孔板試驗(yàn)?zāi)０瀹a(chǎn)生的數(shù)據(jù)，由每個(gè)化合物的10個(gè)數(shù)據(jù) 點(diǎn)來計(jì)算的。在每個(gè)板上對一個(gè)對照化合物和七個(gè)未知的抑制劑進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)板運(yùn)行兩 次。一般而言，化合物從l〇〇yM開始以半對數(shù)進(jìn)行稀釋，在3nM結(jié)束。對照化合物是十字 孢堿。在不存在肽底物的情況下計(jì)算背景。在存在肽底物的情況下測定總活性。用下面的 方案來測定BTK抑制作用。
[0290] 1)樣品制備：以半對數(shù)增量，用試驗(yàn)緩沖液（咪唑，甘油-2-磷酸酯，EGTA，MnCl2， MgCl 2，BSA)對試驗(yàn)化合物進(jìn)行稀釋。
[0291] 2)小珠制備
[0292] a.)通過在500g下離心來對小珠進(jìn)行清洗
[0293] b.)用PBS和EDTA復(fù)溶小珠，從而產(chǎn)生20 %的小珠漿液
[0294] 3)將不含底物的反應(yīng)混合物（試驗(yàn)緩沖液，DTT，ATP，33P ATP)和含底物的反應(yīng)混 合物（試驗(yàn)緩沖液，DTT，ATP，33P ATP，肽底物）在30°C預(yù)培養(yǎng)15分鐘。
[0295] 4)為了開始試驗(yàn)，將10 y L位于酶緩沖液（咪唑，甘油-2-磷酸酯，BSA)中的BTK 和10 y L試驗(yàn)化合物在室溫下預(yù)培養(yǎng)10分鐘。
[0296] 5)向BTK和化合物中加入30 y L不含或含底物的反應(yīng)混合物。
[0297] 6)將共計(jì)50 y L試驗(yàn)混合物在30 °C下培養(yǎng)30分鐘。
[0298] 7)將40 y L試驗(yàn)樣品轉(zhuǎn)移到150 y L位于濾板中的小珠漿液中以終止反應(yīng)。
[0299] 8)在30分鐘后，用下面的步驟洗滌濾板
[0300] a. 3x 250 y L NaCl
[0301] b. 3x 250 y L 包含1%磷酸的 NaCl
[0302] c. lx 250 y L H20
[0303]9)將該板在65 °C下干燥1小時(shí)或者在室溫下干燥一夜
[0304]10)加入50 y L microscint-20并在閃爍計(jì)數(shù)器上對33P cpm進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0305] 由以cpm為單位的原始數(shù)據(jù)計(jì)算百分比活性
[0306] 百分比活性=(樣品-bkg)八總活性-bkg) x 100
[0307] 用單點(diǎn)劑量響應(yīng)S形模型，由百分比活性計(jì)算IC5。
[0308] y = A+((B-A)/(1+((x/C)d))))
[0309] x =化合物濃度，y = %活性，A = min，B = max，C = IC5。，D = 1 (希爾斜率）
[0310] 布魯頓氏酪氨酸激酶（BTK)抑制TR-FRET (時(shí)間分辨FRET)試驗(yàn)
[0311] 該BTK競爭試驗(yàn)利用FRET (熒光共振能量轉(zhuǎn)移）技術(shù)測定化合物對于布魯頓氏酪 氨酸激酶的滅活狀態(tài)的效力（IC50)。將BTK - Eu復(fù)合物在冰上孵育1小時(shí)，然后以起始濃 度 50nM BTK-BioeaseTm:10nM Eu-鏈霉親和素（Perkin-Elmer 目錄號 AD0062)使用。試驗(yàn) 緩沖液由 20mM HEPES(pH 7. 15)、0.1 mM DTT、10mM MgCl2、0. 5mg/ml BSA 和 3%激酶穩(wěn)定劑 (Fremont Biosolutions,目錄號STB-K02)組成。1小時(shí)后，將以上反應(yīng)混合物在試驗(yàn)緩沖 液中稀釋10倍以制得5nM BTK: InM Eu-鏈霉親和素復(fù)合物（供體熒光團(tuán)）。然后將18 y 1 0.1 InM BTK-Eu 和 0.1 InM Kinase Tracer 178 (Invitrogen,目錄號 PV5593)的混合物分 散入384-孔平底板（Greiner, 784076)中，用單獨(dú)的BTK-Eu作為陰性對照。將試驗(yàn)中的待 測化合物以l〇x濃度制備并在DMS0中以半對數(shù)增量進(jìn)行系列稀釋，以產(chǎn)生10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的 曲線。為了開始FRET反應(yīng)，將以10x原液制備的化合物的DMS0溶液加入到板中并將板在 14°C下孵育18-24小時(shí)。
[0312] 孵育后，將該板在BMG Pherastar熒光板讀數(shù)器（或者等同儀器）上讀數(shù)并用于 測定來自銪供體熒光團(tuán)（620nm發(fā)射）和FRET(665nm發(fā)射）的發(fā)射能。將陰性對照孔的值 平均得到平均最低值。將陽性的"無抑制劑"對照孔平均得到平均最大值。將最大FRET的 百分?jǐn)?shù)利用以下等式計(jì)算：
[0313] %最大FRET = lOOx [ (FSR化合物_ FSR平均最小值）/ (FSR平均最大值-FSR平均最小值）]其中 FSR = FRET信號比。％最大FRET曲線在Activity Base (Excel)中繪制并確定IC50 (%)、 希爾斜率、zlP%CV。利用Microsoft Excel從一式兩份的曲線（從兩次獨(dú)立的稀釋得到 的單一抑制曲線）推導(dǎo)出平均IC50和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0314] 在下面的表II中列出了本試驗(yàn)中代表性化合物的數(shù)據(jù)。
[0315]表II
[0316]
[0317] 通討⑶69表汰測量的全血中B細(xì)朐活化的抑制作用
[031