8] -種用于測試BTK抑制劑抑制人血中B細(xì)胞受體介導(dǎo)的B細(xì)胞活化的能力的操作 如下：
[0319] 人全血（HWB)得自健康志愿者，有如下限制條件：24小時(shí)內(nèi)不服藥，不吸煙。通過 靜脈穿刺將血液收集到用肝素鈉抗凝的Vacutainer管中。用PBS(20x)將試驗(yàn)化合物稀釋 至所需的起始藥物濃度的十倍，然后用10% DMS0的PBS溶液進(jìn)行三倍系列稀釋，以產(chǎn)生九 個(gè)點(diǎn)的劑量-響應(yīng)曲線。將5. 5 y 1各化合物的稀釋液一式兩份地加入到2ml的96-孔V 底板（Analytical Sales and Services，#59623-23)中；將 5.5yl 10%DMS0 的 PBS溶液 加入到對(duì)照和無刺激物孔中。向各孔中加入HWB (100 y 1)，在混合后，將這些板在37C，5% C02, 100%濕度下培養(yǎng)30分鐘。在混合的情況下，向各孔中加入Goat F(ab'）2抗-人 IgM(Southern Biotech, #2022-14) (10 y 1 500 y g/ml 溶液，終濃度為 50 y g/ml)(無刺激 物孔除外）并將這些板再培養(yǎng)20小時(shí)。
[0320] 在20小時(shí)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，將這些樣品與熒光-探針-標(biāo)記的抗體（15yl PE 小鼠抗-人 CD20, BD Pharmingen, #555623 和 / 或 20 y 1 APC 小鼠抗-人 CD69, BD Pharmingen#555533) -起在37°(：，5%0)2，100%濕度下培養(yǎng)30分鐘。為了補(bǔ)償調(diào)整和 初始電壓設(shè)置，包括進(jìn)行了誘導(dǎo)的對(duì)照、未染色的和單染色的。然后，將樣品用lml IX Pharmingen溶解緩沖液（BD Pharmingen#555899)進(jìn)行溶解并將這些板在1800rpm下離心 5分鐘。通過抽吸除去上清液，將剩余的沉積物再次用另一份lml IX Pharmingen溶解緩沖 液溶解，如前那樣使這些板離心。將上清液吸出并將剩余的沉積物在FACs緩沖液（PBS+1 % FBS)中進(jìn)行洗滌。在最后一次離心后，除去上清液并將沉積物重新混懸于180 yl FACs緩 沖液中。將樣品轉(zhuǎn)移到適于在BD LSR II流式細(xì)胞儀上的HTS 96孔系統(tǒng)上運(yùn)行的96孔板 中。
[0321] 用適于所用熒光素的激發(fā)和發(fā)射波長，獲取數(shù)據(jù)并用Cell Quest Software獲得 陽性細(xì)胞值百分比。最初用FACS分析軟件（Flow Jo)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。試驗(yàn)化合物的IC50 被定義為用抗-IgM刺激后⑶69-陽性（也是⑶20-陽性的）細(xì)胞百分比降低50%的濃度 (減去未進(jìn)行刺激的背景的8個(gè)孔的均值后的8個(gè)對(duì)照孔的均值）。用XLfit軟件第3版， 方程201來計(jì)算IC50值。
[0322] B-細(xì)朐活化的抑制作用-柃草斯細(xì)朐中的B細(xì)朐FLIPR試驗(yàn)
[0323] 通過測定試驗(yàn)化合物對(duì)抗-IgM刺激的B細(xì)胞響應(yīng)的影響來證明本發(fā)明化合物對(duì) B-細(xì)胞活化的抑制作用。
[0324] B細(xì)胞FLIPR試驗(yàn)是一種測定潛在的抑制劑對(duì)抗-IgM抗體刺激引起的細(xì)胞內(nèi)鈣 增加的影響的以細(xì)胞為基礎(chǔ)的功能性方法。將拉莫斯細(xì)胞（人Burkitt' s淋巴瘤細(xì)胞系， ATCC-No.CRL-1596)在生長培養(yǎng)基（如下所述）中培養(yǎng)。在試驗(yàn)前一天，將拉莫斯細(xì)胞重 新混懸于新鮮的生長培養(yǎng)基（同上）中并將其濃度設(shè)定為在組織培養(yǎng)燒瓶中為〇.5x 106/ mL。在試驗(yàn)當(dāng)天，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并將其濃度設(shè)定為在組織培養(yǎng)燒瓶中，在補(bǔ)加有l(wèi)iiM FLU0-3AM(TefLabs目錄號(hào)：0116,在無水DMS0和10%普朗尼克酸中制備的）的生長培 養(yǎng)基中為lx 106/mL，將其在37°C (4%C02)下培養(yǎng)1小時(shí)。為了除去細(xì)胞外染料，通過離 心（5min，lOOOrpm)收集細(xì)胞，將其以lx 106個(gè)細(xì)胞/mL重新混懸于FLIPR緩沖液（如下 所述）中，然后以每孔lx 1〇5個(gè)細(xì)胞的數(shù)量將其分散到96-孔聚-D-賴氨酸涂布的黑色 /透明板（BD目錄號(hào)：356692)中。以100yM至0. 03yM范圍內(nèi)的各種濃度（7個(gè)濃度， 細(xì)節(jié)如下）加入試驗(yàn)化合物，并使其與細(xì)胞一起在室溫下培養(yǎng)30分鐘。通過加入10 y g/ mL抗-IgM(Southern Biotech,目錄號(hào)：2020_01)來刺激拉莫斯細(xì)胞Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)并在 FLIPR (Molecular Devices，用具有氬激光器的CCD照相機(jī)在480nm激發(fā)下捕捉96孔板的 圖像）上進(jìn)行測量。
[0325] 培養(yǎng)基/緩沖液：
[0326] 生長培養(yǎng)基：含有L-谷氨酰胺（Invitrogen，目錄號(hào)：61870-010)、10%胎牛血 清（FBS, Summit Biotechnology 目錄號(hào)：FP-100_05) ;lmM 丙酮酸鈉（Invitrogen Cat. No. 11360-070)的 RPMI 1640 培養(yǎng)基。
[0327] FLIPR 緩沖液：HBSS(Invitrogen,目錄號(hào)：141175-079)、2mM CaCl2(Sigma 目 錄號(hào)：C-4901)、HEPES(Invitrogen,目錄號(hào)：15630-080)、2. 5mM 丙磺舒（Sigma,目錄號(hào)： P-8761)、0? 1% BSA(Sigma,目錄號(hào)：A-7906)、llmM 葡萄糖（Sigma, Cat-No. G-7528)
[0328] 化合物稀釋細(xì)節(jié)描沭：
[0329] 為了得到100 y M的最高最終試驗(yàn)濃度，將24 y L lOmM化合物儲(chǔ)備液（在DMS0 中制得）直接加入到576 yL FLIPR緩沖液中。將試驗(yàn)化合物用FLIPR緩沖液稀釋（用 Biomek 2000自動(dòng)移液器），得到下面的稀釋系列：基質(zhì)、l.OOx 104M、1.00x 10 5、3.16x 106、1.00x 10 6、3.16x 107、1.00x 10 7、3.16x 10s。
[0330] 試驗(yàn)和分析:
[0331] 用max-min統(tǒng)計(jì)數(shù)值（從由添加刺激性抗體造成的峰減去靜息基線），用 Molecular Devices FLIPR控制和統(tǒng)計(jì)輸出軟件來報(bào)告f丐的分子內(nèi)增加。用非線性曲線擬 合（GraphPad Prism 軟件）來測定 IC50〇
[0332] 小鼠膠原-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（mCIA)
[0333] 在第0天，在尾巴根部或后背的一些點(diǎn)上，用II型膠原在完全弗氏佐劑（CFA)中 的乳劑對(duì)小鼠進(jìn)行注射（i. d.)。在膠原免疫后，動(dòng)物在約21-35天時(shí)出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎。在第21 天，通過全身施用位于不完全弗氏佐劑（IFA;i.d.)中的膠原來使關(guān)節(jié)炎的發(fā)生同步（激 發(fā)）。在第20天之后，每天檢查動(dòng)物是否出現(xiàn)輕度關(guān)節(jié)炎（得分為1或2 ;見下面的評(píng)分說 明），這是激發(fā)的信號(hào)。在激發(fā)后，對(duì)小鼠進(jìn)行評(píng)分并用候選治療劑以規(guī)定的時(shí)間（通常是 2-3周）和給藥頻率每天一次（QD)或每天兩次（BID)進(jìn)行給藥。
[0334] 大鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（rCIA)
[0335] 第0天，在后背的一些位置上，用牛II型膠原在不完全弗氏佐劑（CFA)中的乳劑 對(duì)大鼠進(jìn)行皮內(nèi)（i.d.)注射。在大約第7天，在尾巴根部或背部的另一些部位進(jìn)行膠原乳 劑的加強(qiáng)注射（i. d.)。通常在最初的膠原注射后第12-14天觀察到關(guān)節(jié)炎。從第14天往 后，如下所述（關(guān)節(jié)炎的評(píng)估）那樣對(duì)動(dòng)物的關(guān)節(jié)炎發(fā)展進(jìn)行評(píng)估。從第二次激發(fā)時(shí)開始， 以預(yù)防的方式用候選的治療劑對(duì)動(dòng)物進(jìn)行給藥，以規(guī)定的時(shí)間（通常是2-3周）和給藥頻 率每天一次（QD)或每天兩次（BID)進(jìn)行給藥。
[0336] 關(guān)節(jié)炎評(píng)估:
[0337] 在兩種模型中，都用涉及按照下述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)4只爪子進(jìn)行評(píng)估的評(píng)分系統(tǒng)來對(duì)爪子 和肢體關(guān)節(jié)的炎癥發(fā)展進(jìn)行定量：
[0338] 評(píng)分：1=爪子或一個(gè)指（趾）頭腫脹和/或發(fā)紅
[0339] 2=兩個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)腫脹
[0340] 3 =整個(gè)爪子腫脹，有兩個(gè)以上關(guān)節(jié)涉及
[0341] 4 =整個(gè)爪子和指（趾）頭的嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎
[0342] 在第0天進(jìn)行基礎(chǔ)測量評(píng)估，并在第一個(gè)跡象或腫脹時(shí)再次開始進(jìn)行評(píng)估，每周 評(píng)估最多三次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。通過將各爪子的四種分值相加得到各小鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，給 出每只動(dòng)物最高為16的得分。
[0343] 大鼠體內(nèi)哮喘樽銦
[0344] 用100 y g位于0? 2ml明研^ (alum)中的0A (卵清蛋白）每周一次地對(duì)雄性 Brown-Norway大鼠i. p.給藥進(jìn)行敏化，給藥三周（第0、7和14天）。在第21天（最后一 次敏化后一周），用基質(zhì)或化合物制劑對(duì)大鼠進(jìn)行給藥（q. d.)，在0A氣霧劑激發(fā)（1 % 0A， 45分鐘）前0. 5小時(shí)皮下給藥，在激發(fā)后4或24小時(shí)結(jié)束。在處死時(shí)，由所有的動(dòng)物收集 血清和血漿，分別用于血清學(xué)和PK。插入氣管插管并用PBS對(duì)肺灌洗3次。對(duì)該BAL液進(jìn) 行總白細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。用庫爾特計(jì)數(shù)器測定細(xì)胞等分試樣（20-100 yl)中的 總白細(xì)胞數(shù)。對(duì)于白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)而言，將50-200 y 1樣品在Cytospin中進(jìn)行離心，將載 玻片用Diff-Quik進(jìn)行染色。用標(biāo)準(zhǔn)的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)單核細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、 中心粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的比例進(jìn)行計(jì)數(shù)并以百分比的形式表達(dá)。與對(duì)照水平相比，在0A敏 化和激發(fā)大鼠的BAL中，BTK的代表性抑制劑表現(xiàn)出總白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低。
[0345] 為了清楚和明了，已經(jīng)用舉例說明和實(shí)施例對(duì)前述本發(fā)明的一些細(xì)節(jié)進(jìn)行了描 述。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)進(jìn)行變化和修飾。 因此，應(yīng)當(dāng)清楚的是，上面的說明是用于進(jìn)行說明，并不是用于進(jìn)行限制。因此，本發(fā)明的范 圍不是參考上面的說明書來決定的，而是應(yīng)當(dāng)參考所附的權(quán)利要求書來決定，同時(shí)，也要求 保護(hù)與該類權(quán)利要求等同的所有范圍。
[0346] 本申請(qǐng)中所列舉的所有專利、專利申請(qǐng)和公開物都在與各個(gè)專利、專利申請(qǐng)或公 開物被單獨(dú)指明的程度相同的程度上被全部引入作為參考用于所有目的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 式I的化合物或其可藥用的鹽， 其中：A1是 H 或 A1'； A1'是任選地被一個(gè)或多個(gè)A1''取代的低級(jí)烷基或苯基； 各A1''獨(dú)立地是鹵素或低級(jí)烷基； A2是 H 或 A2'； A2'是任選地被低級(jí)烷基取代的雜芳基； X1是-NH、C( = 0)或不存在； X2是-NH、C( = 0)或不存在； X3是低級(jí)亞烷基或不存在；并且 X4是-NH或不存在。2. 權(quán)利要求1所述的化合物，其中X 1是-NH。3. 權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中X 2是-C( = 0)。4. 權(quán)利要求1-3中的任一項(xiàng)所述的化合物，其中X 3不存在。5. 權(quán)利要求1-4中的任一項(xiàng)所述的化合物，其中A 1是任選地被一個(gè)或多個(gè)A "取代的 苯基。6. 權(quán)利要求1-5中的任一項(xiàng)所述的化合物，其中X 4不存在。7. 權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)所述的化合物，其中A 2是H。8. 權(quán)利要求1所述的化合物，其中X 1是-C( = 0)。9. 權(quán)利要求8所述的化合物，其中X 2是-NH。10. 權(quán)利要求8或9所述的化合物，其中X 3是亞甲基。11. 權(quán)利要求8-10中的任一項(xiàng)所述的化合物，其中A 1是任選地被一個(gè)或多個(gè)A "取代 的苯基。12. 權(quán)利要求8-11中的任一項(xiàng)所述的化合物，其中A 2是H。13. 權(quán)利要求8-12中的任一項(xiàng)所述的化合物，其中X 4不存在。14. 權(quán)利要求1所述的化合物，其中X 4是-NH，A 2是吡唑基并且A 2'是甲基。15. 權(quán)利要求1-14中的任一項(xiàng)所述的化合物，其選自以下化合物： 4_叔丁基-N-[3-(7H-嘌呤-6-基氨基）環(huán)己基]苯甲酰胺； N-[ (3-氯苯基）甲基]-3-(9H-嘌呤-6-基氨基）環(huán)己烷-1-甲酰胺； 6-N-環(huán)己基-2-Ν-(1-甲基吡唑-4-基）-9H-嘌呤-2, 6-二胺； 6-N-(3-甲基環(huán)己基）-2-Ν-(1-甲基吡唑-4-基）-9H-嘌呤-2, 6-二胺；和 4_叔丁基-N-[3-[[2-[(1-甲基吡唑-4-基）氨基]-9H-嘌呤-6-基]氨基]環(huán)己基] 苯甲酰胺。16. 權(quán)利要求1-14中的任一項(xiàng)所述的化合物，其選自以下化合物： 4_叔丁基-N-[3-(9H-嘌呤-6-基氨基）-環(huán)己基]-苯甲酰胺； 3- (9H-嘌呤-6-基氨基）-環(huán)己烷甲酸3-氯-芐基酰胺， N*6*_環(huán)己基-N*2*-(l-甲基-IH-吡唑-4-基）-9H-嘌呤-2, 6-二胺； 腫6*-(3-甲基-環(huán)己基）-陋2*-(1-甲基-1!1-吡唑-4-基）-9!1-嘌呤-2,6-二胺；和 4_叔丁基-N-{3-[2-(1-甲基-IH-吡唑-4-基氨基）-9H-嘌呤-6-基氨基]-環(huán)己 基}_苯甲酰胺。17. -種治療炎性和/或自身免疫性病癥的方法，其包括給需要其的患者施用治療有 效量的權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的化合物。18. -種治療炎性病癥的方法，其包括給需要其的患者施用治療有效量的權(quán)利要求 1-16中任一項(xiàng)所述的化合物。19. 一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其包括給需要其的患者施用治療有效量的權(quán)利 要求1-16中任一項(xiàng)所述的化合物。20. -種治療哮喘的方法，其包括給需要其的患者施用治療有效量的權(quán)利要求1-16中 任一項(xiàng)所述的化合物。21. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的化合物以及至少一種可藥 用的載體、賦形劑或稀釋劑。22. 權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的化合物在治療炎性和/或自身免疫性病癥中的用 途。23. 權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的化合物在制備用于治療炎性和/或自身免疫性病癥 的藥物中的用途。24. 用于治療炎性和/或自身免疫性病癥的權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的化合物。25. 如上所述的本發(fā)明。
【專利摘要】本申請(qǐng)公開了可抑制BTK的通式(I)的化合物，其中所有變量如本文所定義。本文所公開的化合物可用于調(diào)節(jié)BTK的活性并且可用于治療與過度BTK活性有關(guān)的疾病。該化合物還可用于治療與異常B-細(xì)胞增殖有關(guān)的炎性和自身免疫性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明還公開了含有式(I)化合物和至少一種載體、稀釋劑或賦形劑的組合物。
【IPC分類】C07D473/16, A61K31/52, C07D473/34, A61P11/06
【公開號(hào)】CN105073750
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480011832
【發(fā)明人】文森特 菲達(dá)爾格 J·德, R·多米尼克, F·J·羅裴茨-塔比阿, S-S·蘇
【申請(qǐng)人】豪夫邁·羅氏有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2014年3月3日
【公告號(hào)】CA2902375A1, WO2014135473A1