人源化的抗-d因子抗體的制作方法
【專利說明】人源化的抗-D因子抗體
[0001] 本申請是申請日為2007年10月31日、申請?zhí)枮?00780048936.X、名稱為"人源 化的抗-D因子抗體"的發(fā)明申請的分案。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 補體系統(tǒng)在免疫復(fù)合物的清除以及在對感染試劑、外來抗原、病毒-感染細胞和 腫瘤細胞的免疫應(yīng)答中起著重要作用。然而，補體還參與病理性的炎癥以及自身免疫疾病。 因此，對過度或不受控制的補體級聯(lián)激活加以抑制可以對患有這樣的疾病和病情的患者提 供臨床益處。
[0004] 補體系統(tǒng)包括兩個不同激活途徑：經(jīng)典途徑和旁路途徑（V.M.Holers，In ClinicalImmunology:PrinciplesandPractice,R.R.Rich編輯,MosbyPress； 1996, 363-391)。經(jīng)典途徑為鈣/鎂-依賴的級聯(lián)，其通常由抗原-抗體復(fù)合物的形成激 活。旁路途徑為鎂-依賴的級聯(lián)，其通過某些易感表面（例如酵母和細菌的細胞壁多糖以 及某些生物聚合物材料）上C3的沉積和活化而被激活。補體途徑的激活產(chǎn)生補體蛋白質(zhì) 的生物活性片段，例如C3a、C4a和C5a過敏毒素以及C5b-9膜攻擊復(fù)合物（MAC)，它們介導(dǎo) 炎癥活動，包括白細胞趨化反應(yīng)，巨噬細胞、嗜中性粒細胞、血小板、肥大細胞和內(nèi)皮細胞的 活化，血管通透性，細胞溶解以及組織損傷。
[0005]D因子為旁路補體途徑激活必不可缺的高特異性絲氨酸蛋白酶。其裂解結(jié)合C3b 的B因子，產(chǎn)生C3b/Bb酶，其為旁路途徑C3/C5蛋白轉(zhuǎn)化酶的活性組分。D因子可能是 用于抑制的合適靶，因為在人中其血漿濃度非常低（I. 8yg/ml)，并且已經(jīng)證明其為旁路 補體途徑激活的限速酶（P.H.Lesavre和H.J.Muller-Eberhard.J.Exp.Med.，1978 ; 148 : 1498-1510J.E.Volanakis等，NewEng.J.Med.，1985 ;312 :395-401) 〇
[0006] 在動物模型和體外研究中已經(jīng)顯示，下調(diào)補體活性對治療一些疾病 指征有效，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎小球腎炎（Y.Wang等，Proc.Natl.Acad. Sci. ; 1996,93:8563-8568)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Y.Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.; 1995, 92:8955-8959)、心肺體外循環(huán)和血液透析（C.S.Rinder,J.Clin.Invest.，1995 ; 96:1564-1572)、器官移植中的超急性排斥（T.J.Kroshus等，Transplantation, 1995 ; 60:1194-1202)、心肌梗死（J.W.Homeister等，J.Immunol. ,1993;150:1055-1064; H.F.Weisman等，Science, 1990 ;249:146-151)、再灌注損傷（E.A.Amsterdam等，Am. J.Physiol.，1995 ;268:H448-H457)、以及成人呼吸窘迫綜合征（R.Rabinovici等，了. Immunol.，1992 ; 149:1744-1750)。此外，其他炎性病癥和自身免疫/免疫復(fù)合物疾病也 與補體激活緊密相關(guān)（V.M.Holers，ibid.，B.P.Morgan.Eur.J.Clin.Invest.，1994 :24 : 219-228)，包括燙傷、嚴(yán)重哮喘、過敏性休克、腸炎、蕁麻疹、血管性水腫、脈管炎、多發(fā)性硬 化、重癥肌無力、膜增殖性腎小球腎炎和干燥綜合癥（Sjogren's綜合癥）。
[0007] 在補體-介導(dǎo)的病癥領(lǐng)域需要抗體療法，而本發(fā)明人源化的抗體提供了有效滿足 該需求的高親和力抗體。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] -般地，本發(fā)明涉及包含小鼠抗體166-32的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的抗體，小鼠 抗體166-32是能夠抑制與D因子有關(guān)的生物活性的抗體。例如，在18yg/ml濃度時（相 當(dāng)于血液中人D因子摩爾濃度的約1.5倍；抗-D因子抗體與D因子的摩爾比約1.5 :1)，可 以觀察到該抗體顯著抑制旁路補體的活性（參見，例如美國專利號6, 956, 107)。
[0010] 本發(fā)明還涉及小鼠Mab166-32的人源化抗體。本發(fā)明包括這些抗體的可變重鏈 和輕鏈的氨基酸序列以及其相應(yīng)的核酸序列。本發(fā)明的另一個實施方案包括這些抗體的 ⑶R序列。
[0011] 本發(fā)明的另一個實施方案包括包含本發(fā)明抗體的組合物。在另一個實施方案中， 本發(fā)明提供了含有本發(fā)明抗體序列的細胞系和載體。在一個方面，本發(fā)明包括制備和使用 本發(fā)明抗體和組合物的方法。
[0012] 本發(fā)明的另一個實施方案是這些人源化抗體在制備治療與過度或不受控制的補 體激活有關(guān)的病癥的藥物或組合物中的應(yīng)用。所述病癥包括心肺體外循環(huán)期間的補體 激活，由急性心肌梗塞、動脈瘤、中風(fēng)、出血性休克、擠壓傷、多器官衰竭、低血容量性休克 (hypobolemicshock)、腸局部缺血或引起局部缺血的其他事件后的缺血-再灌注而引起的 補體激活。還顯示補體激活與炎性病癥有關(guān)，如嚴(yán)重?zé)齻?、?nèi)毒素血癥、膿毒性休克、成人呼 吸窘迫綜合征、血液透析、過敏性休克、嚴(yán)重哮喘、血管性水腫、克羅恩氏病、鐮刀形紅細胞 貧血病、鏈球菌感染后腎小球腎炎和胰腺炎。病癥可以是不良藥物反應(yīng)、藥物過敏、IL-2誘 導(dǎo)的血管滲漏綜合癥或放射攝影造影劑過敏的結(jié)果。它還包括自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅 斑狼瘡、重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默氏病和多發(fā)性硬化。補體激活還與移植 排斥有關(guān)。此外，補體激活與眼病如年齡-相關(guān)的黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病有關(guān)。
[0013] 附圖簡述
[0014] 圖IA和IB描述了小鼠MAb166-32可變重鏈（圖1A)和可變輕鏈（圖1B)的氨 基酸序列。
[0015] 圖2A和2B描述了小鼠MAb166-32可變重鏈（圖2A)和可變輕鏈（圖2B)的核 酸序列。
[0016] 圖3描述了小鼠MAb166-32重鏈的比對。
[0017] 圖4描述了小鼠MAb166-32輕鏈的比對。
[0018] 圖5描述了每一個人源化抗體克隆#56、#111、#250和#416的可變重鏈和可變輕 鏈的氨基酸序列。
[0019] 圖6描述了人源化抗體Fab克隆#56、#111、#250和#416的溶血實驗結(jié)果。
[0020] 圖7描述了人源化抗體Fab克隆#56、#111、#250和#416對旁路補體激活的抑制。
[0021 ] 圖8A-B(可變重鏈（VH)共有框架）和圖9A-B(可變輕鏈（VL)共有框架）描述了 示例性的受者人共有框架序列，其可用于實施本發(fā)明并具有如下序列標(biāo)識符：（圖8A-B)人VH亞組I共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:28)、人VH亞組I共有框架減去延伸的高變 區(qū)（SEQIDNO:29-31)、人VH亞組II共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:32)、人VH亞 組II共有框架減去延伸的高變區(qū)（SEQIDNO:33-35)、人VH亞組III共有框架減去Kabat CDR(SEQIDNO: 36)、人VH亞組III共有框架減去延伸的高變區(qū)（SEQIDNO: 37-39)、人VH 亞組VII共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:55)、人VH亞組VII共有框架減去延伸的高 變區(qū)（SEQIDNO:56-58)、人VH受體框架減去KabatCDR(SEQIDNO:40)、人VH受體框架 減去延伸的高變區(qū)（SEQIDNO:41-42)、人VH受體2框架減去KabatCDR(SEQIDNO:43) 和人VH受體2框架減去延伸的高變區(qū)（SEQIDNO:44-46)以及（圖9A-B)人VLK亞組I共有框架（3￡〇10勵：47)、人￥1^亞組11共有框架（3￡〇10勵：48)、人1〇亞組111共有 框架（SEQIDNO:49)和人K亞組IV共有框架（SEQIDNO:50)。
[0022] 發(fā)明詳述
[0023] 定義
[0024] 本文全篇中所用的術(shù)語應(yīng)解釋為具有對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言常規(guī)和典型的 意義。然而，申請人希望給予下列術(shù)語如下特定定義。
[0025] 短語"基本一致"相對于抗體鏈多肽序列而言可以被解釋為抗體鏈與參考多肽序 列有至少約70%、80%、90%或95%的序列一致性。對于核酸序列，該術(shù)語可以被解釋為核 苷酸序列與參考核酸序列有至少約85%、90%、95%或97%的序列一致性。
[0026] 術(shù)語"一致性"或"同源性"應(yīng)解釋成是指，在比對序列并引入空隙（如果需要，以 使整個序列達到最大的序列一致性百分比）之后，并且不考慮保守替代作為序列一致性的 一部分時，候選序列中和與其比較的對應(yīng)序列中的殘基相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。N端或 C端延伸或插入不應(yīng)被理解成是減少了一致性或同源性。用于比對的方法和計算機程序是 本領(lǐng)域所熟知的。用序列分析軟件可以測定序列一致性。
[0027] 術(shù)語"抗體"以其最廣的意義使用，并且特定地包括：單克隆抗體（包括全長的 單克隆抗體）、多克隆抗體和多特異性抗體（例如雙特異性抗體）?？贵w（Ab)和免疫球蛋 白（Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w對特定靶表現(xiàn)出結(jié)合特異性，而免疫球蛋白 則包括抗體以及缺乏靶特異性的其它抗體樣分子。天然抗體和天然免疫球蛋白通常是約 150, 000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈（L)和兩個相同的重鏈（H)組成。 每條重鏈的一端有可變區(qū)（VH)，其后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)（VL)，另一 端是恒定區(qū)。
[0028] 此處所用的"抗-人D因子抗體"指以抑制或基本上降低補體激活的方式特異性 結(jié)合人D因子的抗體。
[0029] 在抗體可變區(qū)語境中所用的術(shù)語"可變"指：在抗體之間可變區(qū)的某些部分在序列 上有很大的不同，并且這些部分在每個特定抗體對其特定靶的結(jié)合和特異性中有作用。然 而，可變性并非均勻地分布在抗體可變區(qū)中。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補決定 區(qū)（CDR)(也稱為高變區(qū)（HVR))的三個節(jié)段中。可變區(qū)中更高度共有的部分稱為框架（FR)。 天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包含四個FR區(qū)，它們大多數(shù)采取折疊構(gòu)型，由三個CDR連 接，該三個⑶R連接形成環(huán)連接且在某些情況下形成P折疊的一部分。每條鏈中的多個CRD 通過FR區(qū)連接在相鄰近的位置，并且和另一條鏈的CDR-起形成抗體的靶結(jié)合部位（參見 Kabat等）。除非另外指明，如此處所用的，免疫球蛋白氨基酸殘基的編號是根據(jù)Kabat等 (SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，NationalInstituteofHealth, Bethesda，Md. 1987)的免疫球蛋白氨基酸殘基編號系統(tǒng)來進行的。
[0030] 術(shù)語"高變區(qū)"、"HVR"或"HV"在此使用時指其序列高度可變的和/或形成結(jié)構(gòu)限 定環(huán)的抗體可變區(qū)的區(qū)域。通常，抗體包括6個高變區(qū)：3個在VH中〇11、112、113)，3個在￥1 中（L1、L2、L3)。本發(fā)明使用并包括許多高變區(qū)描述。Kabat互補決定區(qū)（⑶R)是基于序列 可變性的且最常用（Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第 五版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD. (1991)) 〇 而Chothia指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置（Chothia和LeskJ.Mol.Biol. 196 :901-917 (1987))。AbM高 變區(qū)代表KabatQ)R和Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，并且為OxfordMolecyIar的AbM抗 體模型軟件所使用。"接觸"高變區(qū)是基于可獲得的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)分析。來自每個這些高變 區(qū)的殘基記錄如下。
[0031]
[0032]Kabat編號
[0033]HlH31-H35H26-H35H26-H32H30-H35
[0034]Chothia編號
[0035]
[0036] 高變區(qū)可包括如下"延伸的高變區(qū)" ：VL中的24-36或24-34 (LI)、46-56或 5〇-56(12)和89-97(1^3)以及￥11中的 26-35〇11)、5〇-65或49-65〇12)和93-102、94-102 或 95-102 (H3)。每個這些定義的可變區(qū)殘基根據(jù)上文的Kabat進行編號。
[0037] "框架"或"FR"殘基為此處定義的除高變區(qū)殘基或CDR殘基以外的可變區(qū)殘基。
[0038] 術(shù)語"如Kabat編號的可變區(qū)殘基"或"如Kabat編號的氨基酸位點"及其變體，指 Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，PublicHealth Service,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD. (1991)中用于抗體編譯的重鏈 可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的編號系統(tǒng)。利用該編號系統(tǒng)，事實上線性的氨基酸序列相應(yīng)于對可 變區(qū)FR或CDR的截短或插入可包含更少的或額外的氨基酸。例如，重鏈可變區(qū)可包括H2 的殘基52后的單個氨基酸插入（根據(jù)Kabat為殘基52a)以及重鏈FR殘基82后插入的殘 基（例如根據(jù)Kabat為殘基82a、82b和82c等等）。對于給定的抗體，可通過將該抗體序列 的同源區(qū)域與"標(biāo)準(zhǔn)的"Kabat編號序列進行比對來確定其Kabat殘基編號。
[0039]Kabat編號系統(tǒng)通常在提及可變區(qū)中的殘基（大約輕鏈的殘基1-107以及重鏈 的殘基 1_113)時使用（例如，Kabat等，SequencesofImmunologicalInterest,第五 版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md. (1991))〇 "EU編號系統(tǒng)"或"EU索引"通常在提及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時使用（例如， 上文Kabat等中報道的EU索引；重鏈恒定區(qū)中的鉸鏈區(qū)大約為重鏈的殘基216-230 (EU編 號））。"如Kabat中的EU索引"指人IgGlEU抗體的殘基編號。除非此處另有說明，抗體可 變區(qū)中的殘基編號的參照物指通過Kabat編號系統(tǒng)編號的殘基。除非此處另有說明，抗體 恒定區(qū)中的殘基編號的參照物指通過EU編號系統(tǒng)編號的殘基（例如，參見美國臨時申請?zhí)?60/640, 323,EU編號的圖）。
[0040] 術(shù)語"抗體片段"指全長抗體的一部分，通常是靶結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例 子包括？ &13、？&13'、？(&13'）2和？7片段。短語抗體的"功能性片段或類似物"為具有與全長 抗體相同的定性生物學(xué)活性的化合物。例如，抗-人D因子抗體的功能性片段或類似物為 可以以阻止或基本上降低補體激活的方式結(jié)合D因子的一種化合物。如此處所用的，對于 抗體"功能性片段"是指Fv、F(ab)和F(ab'）2片段。"Fv"片段是含有全部靶識別和結(jié)合位 點的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共價關(guān)聯(lián)的一個重鏈可變區(qū)和一個輕鏈可變區(qū)的二 聚物（VH_\二聚物）組成。在該構(gòu)型中，各可變區(qū)中的三個CDR相互作用，從而形成VH-\ 二聚物表面上的靶結(jié)合位點。6個CDR共同