治療醫(yī)師的判斷。
[0155] 根據(jù)疾病的類型和嚴重程度，無論是通過例如一次或多次分開施用還是連續(xù)輸 注，施用于患者的抗體初始候選劑量大約是0.lmg/kg至150mg/kg(例如0.l-20mg/kg)。根 據(jù)上述因素，典型的每日劑量可以在大約lmg/kg至100mg/kg或以上的范圍內(nèi)。對于幾天 或更長時間內(nèi)的重復施用，根據(jù)病征，應維持治療直至疾病癥狀受到所需的抑制。然而，可 采用其它劑量方案。這種治療的進程很容易用常規(guī)技術(shù)和實驗來監(jiān)測。示例性的劑量方案 公開在W094/04188中。
[0156] 抗體組合物可以以與良好的醫(yī)學實踐相一致的方式配制、按劑量給藥或施用。在 本文上下文中考慮的因素包括待治療的特定的疾病、待治療的特定的哺乳動物、患者個體 的臨床狀況、病因、遞送試劑的部位、施用方法、施用方案以及醫(yī)生所知的其它因素。所施用 的抗體的"治療有效量"將由這些考慮因素決定，并且是預防、改進或治療疾病或失調(diào)所需 的最少量?？贵w不需要但任選地可以與目前使用的一種或多種試劑配制在一起，以預防或 治療所討論的疾病。所述其他試劑的有效量取決于制劑中抗體的量、疾病或治療的類型、以 及上述的其它因素。這些試劑的用量和施用途徑通常和上文所用的相同，或者約為上文所 用劑量的1-99%。
[0157] 識別D因子作為其靶的本發(fā)明抗體可用于治療補體介導的病癥。這些病癥與過度 的或不受控制的補體激活有關(guān)。它們包括：心肺體外循環(huán)期間的補體激活；急性心肌梗塞、 動脈瘤、中風、出血性休克、擠壓傷、多器官衰竭、低血容量性休克、腸局部缺血后的局部缺 血再灌注引起的補體激活。病癥還可以包括的疾病或病情為炎癥病情，如嚴重燒傷、內(nèi)毒素 血癥、膿毒性休克、成人呼吸窘迫綜合征、血液透析、過敏性休克、嚴重哮喘、血管性水腫、克 羅恩氏病、鐮刀形紅細胞貧血病、鏈球菌感染后腎小球腎炎和胰腺炎。所述病癥可以是不良 藥物反應、藥物過敏、IL-2誘導的血管滲漏綜合癥或放射攝影造影劑過敏的結(jié)果。所述病 癥還包括自身免疫性疾病如全身性紅斑狼瘡、重癥肌無力、類風濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默氏 病和多發(fā)性硬化。補體激活還與移植排斥有關(guān)。最近已表明補體激活和眼病如年齡相關(guān)的 黃斑變性，糖尿病性視網(wǎng)膜病之間強烈相關(guān)。 實施例
[0158] 提供下列實施例進行說明，而非進行限制。
[0159] 實施例I:D因子小鼠MAbl66_32的人源化。
[0160] 將小鼠mAbl66-32的重鏈可變區(qū)（Vh)和輕鏈可變區(qū)（Vt)序列與公共數(shù)據(jù)庫中可 利用的人抗體系序列比較。在如上述步驟1中確定模板時使用一些標準，包括全長、框架區(qū) 內(nèi)類似的CDR位點、整體同源性、CDR的大小等。所有這些標準一起提供結(jié)果用于選擇最優(yōu) 的人模板，如166-32MAb重鏈和輕鏈序列與圖3和4中描述的各個人模板序列之間的序列 比對所示。
[0161] 在這種情況下，用多個人框架模板設(shè)計所述抗體。選擇用于Vh鏈的人模板為 VI-4.lb+(7-04. 1基因座）（登錄號#X62110) (VH7家族）與JH4d(參見圖3)的組合。選擇 用于\鏈的人模板為DPK4(VKI家族）與JK2的組合（參見圖4)。
[0162] -旦選擇了模板，通過DNA合成與重疊PCR構(gòu)建Fab文庫。文庫由用各自選擇的 人模板合成的MAb166-32⑶R組成。編碼部分￥"與V 列的重疊核苷酸在約63至約76 個核苷酸范圍內(nèi)被合成，其具有18至21個核苷酸重疊。構(gòu)建表達抗D因子抗原的人源化Fab文庫的載體，并且轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DHlOB中，隨后在XL-IB細菌菌苔上鋪板。
[0163] 用規(guī)模（獨立克隆的數(shù)目）和多樣性（突變體的分布）來評估文庫質(zhì)量。具有輕 鏈和重鏈雙插入的單個克隆在測序的20個中為約14個。框架擺動突變體均勻分布。
[0164]PCR擴增\和Vh基因，利用包含框架區(qū)FRl的序列和與前導序列末端退火的突出 端序列（GeneIII)的生物素化正向引物，以及來自保守恒定區(qū)（CkSCHI)的反向引物，在 標準PCR條件下進行。通過瓊脂糖凝膠電泳或通過商業(yè)的PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物以 去除未反應的生物素化引物和非特異性PCR。
[0165] 實施例2:文庫篩選
[0166] 用捕獲過濾挖出法（CaptureFilterLift)進行初步篩選。實際的篩選規(guī)模比理 論文庫的規(guī)模大3倍。候選者進一步通過單點ELISA實驗篩選?；贔ab濃度，利用D因 子直接抗原滴定法進一步確定最好的結(jié)合劑。
[0167] 捕獲挖出篩選
[0168] 用捕獲過濾挖出法進行Fab結(jié)合D因子的初步篩選。高效價的噬菌體在37°C中植 于平皿中并且孵育直至使用（約6-8小時）。山羊抗-人K在10mlPBST中稀釋至IOyg/ ml;根據(jù)標準的斑點挖取流程制備用于挖取斑點的硝酸纖維素濾膜，隨后浸入振蕩器上的 IOml封閉緩沖液中2小時。濾膜用PBST漂洗3次。濾膜用于斑點菌苔并且在RT孵育大約 15-24小時。隨后從平皿移去濾膜并且用TBST漂洗3次。
[0169]D因子（50yg/ml)在PBST中稀釋至0.Iyg/ml并且每個濾膜添加4ml。濾膜在 振蕩器上溶液中RT孵育2小時，隨后漂洗3次，每次5分鐘。稀釋的166-222-HRP(用PBST 以1 :10, 000稀釋）以每個濾膜4ml的體積添加并且在振蕩器上溫育1小時。濾膜漂洗4 次。干燥濾膜并隨后浸入TMB底物中，接著浸入水中以終止反應。鑒定陽性克隆。
[0170] 實施例3 :單點ELISA篩選
[0171] 用單點ELISA實驗進行第二次篩選。用山羊抗-人Fab包被ImmyIonII平皿 (1 :12, 000,50y1/孔），RT過夜。第二天用平皿洗滌劑洗滌平皿4次。以每孔100y1的 體積添加封閉緩沖液并且平皿在RT孵育1小時。隨后洗滌平皿4次。
[0172] 所要篩選的每種Fab以每孔50y1的體積添加（或者來自15ml周質(zhì)制備物或上 清）并且在RT溫育1小時。洗滌平皿4次，隨后添加0. 01yg/ml的50y1/孔生物素化的 D因子。在RT孵育平皿1小時后洗滌4次。添加鏈親和素-HRP(PBST中1 : 10, 000)并且 在RT溫育1小時。洗滌平皿5次，隨后通過以50y1/孔添加TMB底物而顯影。當其很好 地顯影（10-45分鐘）時添加50y1體積的終止緩沖液并且在450nm讀取平皿。
[0173] 實施例4 :人源化抗D因子克隆的測序
[0174] 對與人D因子具有良好結(jié)合親和力的16個人源化克隆測序（參見表1)。這當中， 輕鏈中的位點2 (100%人）和49 (100%小鼠）和重鏈中的位點93 (100%小鼠）為高度保守 的，表明其對于維持抗體的結(jié)合能力很重要。
[0175] 表1.來自人源化文庫的人源化克隆的氨基酸序列分析
[0176]
[0177] 通過BIAcore分析和溶血抑制實驗評估克隆#56。BIAcore分析表明克隆#56具 有與嵌合的166-32Fab類似的對人D因子的親和力（參見表4)。溶血抑制實驗表明克隆 #56比嵌合的166-32Fab更加有效力（參見圖6)。克隆#56含有輕鏈框架中的兩個小鼠殘 基以及重鏈中的四個小鼠殘基（參見表1)。基于這些結(jié)果，進行進一步的優(yōu)化。
[0178] 表2.來自人源化/CDR3優(yōu)化文庫的優(yōu)化抗體的氨基酸序列分析
[0179]
[0180]
[0181] 通過BIAcore分析表征克隆#111和#114(參見表4)?？寺?104、#111、#114和 #130還通過溶血抑制實驗來表征（參見圖6)。這些克隆具有比嵌合的166-32更高的親和 力，并且如通過溶血抑制實驗所示，對抑制旁路途徑比嵌合的Fab更有效（圖7)。克隆#111 含有與克隆#56相同的兩個輕鏈中的小鼠殘基（位點4和49)。如克隆#56中發(fā)現(xiàn)的，其 在重鏈位點97處也含有保守的小鼠殘基?？寺?111的輕鏈和重鏈中均存在一個有益的突 變。從兩個獨立的篩選文庫（人源化文庫和人源化/CDR3優(yōu)化文庫），發(fā)現(xiàn)最好克隆具有類 似的共有序列殘基。
[0182] 為了進一步優(yōu)化克隆#111的親和力，通過將單突變同時引入⑶R-Hl和⑶R-L2中 來構(gòu)建抗體文庫。簡言之，通過將編碼單突變的寡核苷酸退火至克隆#111的模板，用定點 誘變方法構(gòu)建所述文庫。對人D因子具有很高親和力的總共24個克隆被測序。在這24個 克隆當中，鑒定一些冗余有益突變。選擇克隆#250、#315、#345和#416用于BIAcore分析 (參見表4)。BIAcore數(shù)據(jù)表明這些克隆比原始克隆#111對人D因子的親和力更高?？寺?#250、#315、#348和#416也在溶血抑制實驗中（參見圖6)和旁路途徑的抑制中（圖7)測 試。
[0183] 實施例5:AP溶血實驗
[0184] 利用溶血抑制實驗和BIAcore分析測定人源化克隆的生物學功能（參見以下實施 例6)。根據(jù)下列流程進行溶血實驗。從20ml鹽水（0. 9%NaCl)中1 :20稀釋的兔紅血細胞 (RRBC) (0? 5ml+9. 5mlGVB/Mg-EGTA緩沖液）（大約 1:2XIO4稀釋），取 20y1 通過Coulter 計數(shù)器計數(shù)。細胞濃度隨后調(diào)整至約2-5XIO4細胞/ml。每個平皿接受約500X10 6/平皿 RRBC或約ImlRRBC/平皿（500X106/2-5X104)。
[0185] 細胞稀釋于6mlGVB/Mg-EGTA緩沖液/平皿，在4°C以1360rpmX4分鐘離心而混 合并洗滌3次。RRBC小團沉淀物懸浮于3mlGVB/Mg-EGTA緩沖液/平皿中并且保存于冰 上。
[0186] 在使用之前融解來自-80°C冰箱的人血清。血清稀釋于GVB/Mg-EGTA緩沖液中至 20 %的濃度，5ml/平皿（最終為10% )并且保存于冰上。
[0187]表 3
[0188]
[0189] 樣品在5-6°C振蕩30秒且隨后在37°C振蕩40分鐘。樣品在振蕩時冷卻至5-6°C 且隨后在4°C，2,OOOrpm離心3分鐘。轉(zhuǎn)移大約80y1上清液至平底96孔平皿并且利用標 準的平皿讀數(shù)器讀取590nm的OD值。如下計算抑制百分比：％抑制={[ (S-SB)-(U-SB)]/ (S-SB)}X100%。（U=樣品1、2或3(分別為表3的第1、2或3列））。
[0190] 實施例6:通過BiaCore動力學分析抗-人D因子Fab
[0191] 固定：人D因子（AdvancedResearchlnc，0.lmg/ml)利用胺-偶聯(lián)方法直接固定 在CM5芯片上（BiaCore)。流程簡要描述如下：（1)恒流（PBS)為5y1/min。（2)注入35y1 EDC/NHS(I: 1)。（3)注入pH4. 5的35y1乙酸鹽緩沖液中的人D因子。（4)注入35y1乙 醇胺阻斷激活的組。（5)用5iUpHL5的IOmM甘氨酸凈化表面。配體（人D因子）固定 水平為約1，000RU。利用a人D因子（huDi，40y1，31. 5yg/ml)檢驗產(chǎn)生約900RU的相對 應答。
[0192] 動力學分析：所有抗-人D因子Fab稀釋于PBS緩沖液中。每個樣品用連續(xù)稀釋 的方式制備：12. 5礎(chǔ)、2511]\1、5〇11]\1、7511]\1、10〇11]\1、12511]\1和15〇11]\1，以高采集率的4(^1脈沖 注入。通過施加5iilpH1.5的IOmM甘氨酸脈沖實現(xiàn)再生。通過在擬一階動力學下利用 BIAvaluation3. 0版本將Fab結(jié)合痕跡擬合至1 :1結(jié)合模型而獲得動力學參數(shù)。結(jié)果在 以下表4中呈現(xiàn)。通過全局擬合程序獲得所有的數(shù)據(jù)。
[0193]表4BIAcore結(jié)果
[0194] Fab克隆
[0195]
[0196] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到或僅僅利用常規(guī)實驗能夠確定此處所述的本發(fā)明具體 實施方案的許多等同方案。所述等同方案由下列權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項】
1.抗-D因子抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有與SEQ ID NO: 5具有至少99%% - 致性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)以及具有與SEQ ID NO: 6具有至少99% % -致性的氨基酸 序列的重鏈可變區(qū)。2.抗-D因子抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有與SEQ ID NO: 7具有至少99%% - 致性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)以及具有與SEQ ID NO: 8具有至少99% % -致性的氨基酸 序列的重鏈可變區(qū)。3.抗-D因子抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有與SEQ ID N0:9具有至少99%% - 致性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)以及具有與SEQ ID NO: 10具有至少99%%-致性的氨基 酸序列的重鏈可變區(qū)。4.抗-D因子抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有與SEQ ID NO: 11具有至少99%% - 致性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)以及具有與SEQ ID NO: 12具有至少99%%-致性的氨基 酸序列的重鏈可變區(qū)。5.如權(quán)利要求2所述的抗-D因子抗體或其抗原結(jié)合片段，其中SEQ ID NO :7的位點 104處的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸。6. 分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1-5的任一項的抗體或其抗原結(jié)合片段。7.包含權(quán)利要求6的核酸的載體。8. 包含權(quán)利要求7的載體的宿主細胞。9.包含權(quán)利要求1-5的任一項的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。10. 權(quán)利要求9的組合物在制備用于治療補體介導的病癥的藥物中用途。11. 如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述病癥是眼病。12. 如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述眼病是年齡相關(guān)的黃斑變性或糖尿病性視網(wǎng) 膜病。13.生成抗-D因子抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其包括： (i) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求8的宿主細胞；和 (ii) 純化表達的抗體或片段。14.通過權(quán)利要求13的方法獲得的抗-D因子抗體或其抗原結(jié)合片段。
【專利摘要】本發(fā)明涉及人源化的抗-人D因子單克隆抗體、它們的核酸和氨基酸序列、含有這些抗體的細胞和載體以及這些抗體在制備用于治療與過度或不受控制的補體激活有關(guān)的疾病和病癥的組合物和藥物中的應用。這些抗體可用于疾病的診斷、預防和治療。
【IPC分類】A61P27/02, A61P9/10, A61K39/395, C07K16/40, C12N15/13
【公開號】CN105085682
【申請?zhí)枴緾N201510511513
【發(fā)明人】赫倫·吳, 桑賈耶·辛格, S·C·馮, 安玲玲, 亨利·B·洛曼, 羅伯特·F·凱萊
【申請人】健泰科生物技術(shù)公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2007年10月31日
【公告號】CA2667997A1, CN101589063A, EP2097455A2, EP2097455B1, EP2471818A1, EP2907827A1, US8067002, US8187604, US8193329, US8372403, US8753826, US20080118506, US20110123528, US20110165622, US20120230985, US20130171070, US20140303355, WO2008055206A2, WO2008055206A3, WO2008055206A9