一種小球藻多糖的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小球藻多糖的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小球藻（Chlorellaspp.)為一類普生性單細胞綠藻，屬于綠藻門（Chlorphyta) 綠藻綱（Chlo-rophyceae)綠球藻目（ChlorocOccales)卵囊藻科（Oocystaceae)球藻屬 (Chlorella)。現(xiàn)世界上已知的小球藻有15種之多。小球藻體內(nèi)含有豐富的生物活性物 質(zhì)，如不飽和脂肪酸、色素、蛋白質(zhì)、多糖等，具有抗腫瘤、抗菌和抗病毒，防治消化性潰瘍和 缺鐵性貧血、抗高血脂癥和動脈粥樣硬化、抗輻射、解毒保肝和降低血壓等多種功能。小球 藻具有生態(tài)分布廣、可快速生長和繁殖、易于培養(yǎng)等優(yōu)點，是地球上動植物中唯一能在20h 增長4倍的生物，具有很高的應(yīng)用價值。目前小球藻已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在動物飼料、食品添加 劑、醫(yī)藥制劑、美容產(chǎn)品等方面。大量研究證明，小球藻多糖的生物活性多樣，具有抗菌、增 強免疫力功能、降血糖以及較為顯著的抗癌、抗腫瘤活性已成為關(guān)注的熱點。傳統(tǒng)的多糖提 取方法主要有：水提醇沉法、酸提法和堿提法、熱水抽提法，傳統(tǒng)高溫、酸性、堿性提取條件 下，可導(dǎo)致多糖降解，并且會使粗多糖的樣品顏色變深，雜質(zhì)較多。近年來超臨界流體萃取 法成為一種新的提取分離技術(shù)，具有保持有效成分的活性和無溶劑殘留等優(yōu)點。但是設(shè)備 復(fù)雜，運行成本高，提取范圍窄。因而沒有被廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能耗低、生產(chǎn)成本低、小球藻多糖 提取率、回收率尚的提取方法。
[0004] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0005] -種小球藻多糖的提取方法，其提取方法如圖1。
[0006] -種小球藻多糖的提取方法，其具體操作步驟如下：
[0007] 1、預(yù)處理：將小球藻粉加水配制成濃度為5 %~10 %混懸液，置于60°C水浴箱中 Ih并不斷攪拌；
[0008] 2、凍融、超聲波處理：將小球藻混懸液，經(jīng)~20°C冷凍，室溫下解凍。重復(fù)凍融過 程4次，每次冷凍12h;后加入3~5mL、pH7. 0、濃度為0.Olmol/L磷酸緩沖液，超聲波處理 (400~600W，時間4~6min)，于2000~2500r/min條件下離心5min,過濾，濾液備用；
[0009] 3、酶解濾渣：將步驟2中濾渣加水配制成10~20%溶液，加入胰蛋白酶,酶解溫度 均為50~60°C，酶解時間2h;離心，轉(zhuǎn)速控制為3000~4000r/min，時間為lOmin，過濾，濾 液備用；所述的胰蛋白酶活性為3000U/mg;所述的濾液：胰蛋白酶重量之比為100:0. 5 ;
[0010] 4、減壓濃縮與醇析：將步驟2與步驟3中濾液合并混勻，減壓濃縮至濾液體積的 十分之一，即得濃縮液，加入95%的無水乙醇混合均勾，置于搖床30~45min;，4000~ 5000r/min條件下離心IOmin,棄去上清液，即得粗多糖；所述的濃縮液：95%無水乙醇重量 比為1:2;
[0011] 5、多糖純化：將粗多糖，溶入250mL蒸餾水中，用80%的三氯乙酸調(diào)節(jié)pH值為 4. 0~6. 0,靜置12~18h，8000r/min條件下離心5min，取上清液；冷凍干燥，即得多糖。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)勢在于：本發(fā)明采用凍融法是低溫冷凍與室溫融化交替進行的一種 破壁方法，促使細胞完全破裂的同時避免了高溫對原料所造成的營養(yǎng)損失、有效成分破壞 嚴(yán)重的不良影響。同時超聲波輔助提取小球藻多糖，機械作用也加速細胞壁的破碎，促進胞 內(nèi)多糖活性物質(zhì)的快速溶出。與傳統(tǒng)多糖提取相比，交替凍融破壁和超聲波輔助提取有效 結(jié)合，具有能耗低、多糖提取率、回收率高，生產(chǎn)成本低的特點。通過本發(fā)明凍融聯(lián)合超聲 波提取方法，小球藻多糖提取率、回收率分別是傳統(tǒng)提取方法的1. 34~1. 39倍以及I. 1~ 1. 58 倍。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發(fā)明提取小球藻多糖的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1
[0015] 1、預(yù)處理：稱取100g小球藻粉溶于500ml蒸餾水中配制成濃度為5%混懸液，置 于60°C水浴箱中Ih并不斷攪拌；
[0016] 2、凍融、超聲波處理：將小球藻混懸液，經(jīng)~20°C冷凍，室溫下解凍。重復(fù)凍融 過程4次，每次冷凍12h;后加入3mL、pH7. 0、濃度為0.Olmol/L磷酸緩沖液，超聲波處理 (400W，時間4min)，于2000r/min超速離心機中離心5min,過濾，濾液備用；
[0017] 3、酶解濾渣：將步驟2中濾渣加蒸餾水200ml配制成10%溶液，加入胰蛋白酶 I. 0ml，酶解溫度60°C，酶解時間2h，離心，轉(zhuǎn)速控制為4000r/min，時間為lOmin，過濾，濾液 備用；
[0018] 4、減壓濃縮與醇析：將步驟2與步驟3中濾液合并減壓濃縮至70ml，加入 140ml95%的無水乙醇混合均勾，置于搖床30min;，5000r/min條件下離心IOmin,棄去上 清液，即得粗多糖；
[0019] 5、多糖純化：將粗多糖，溶入250mL蒸餾水中，用80%的三氯乙酸調(diào)節(jié)pH值為 6. 0,靜置16h，8000r/min條件下離心5min，取上清液；冷凍干燥，即得多糖。
[0020] 小球藻多糖不同提取方法提取率測定試驗
[0021] 1、材料與方法
[0022] 小球藻藻粉：江蘇明天生物科技有限公司
[0023] 2、小球藻多糖提取方法
[0024] 取100g小球藻粉，以蒸餾水500ml，分別采用如下：
[0025] 1)、連續(xù)加熱回流提?。ㄋ魇咸崛∑鳎好看翁崛?h，提取2次，合并提取液；
[0026] 2)、超聲波提?。撼?0min，熱水回流提取2h，提取2次，合并提取液；
[0027]3)、閃式提取器提取：閃式破碎lOmin，提取2次，合并提取液；
[0028]4)、凍融+超聲波提取：提取方法同本發(fā)明實施例1 一致；
[0029] 3、小球藻多糖含量測定方法
[0030] 3. 1粗多糖提取率測定
[0031] 采用苯酸~硫酸法測定，用葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物，在490nm波長處測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量濃 度與吸光度的對應(yīng)關(guān)系，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍染色法測定。用牛血清 蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物，在595nm波長測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量濃度與吸光度的對應(yīng)關(guān)系，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。 [0032] 3.Ll粗多糖提取率％ =(粗多糖質(zhì)量/小球藻粉質(zhì)量）X100%
[0033] 3. 2多糖純化
[0034] 取I.Og粗多糖，溶入200mL蒸餾水中，用80%的三氯乙酸調(diào)節(jié)pH值6,靜置12h， 離心，取上清