液，計算多糖回收率。
[0035] 3. 2. 1多糖回收率=(純化后多糖含量/粗多糖含量）X100%
[0036] 4、測定結果
[0037] 4. 1葡萄糖標準曲線的繪制回歸方程為，y= 9. 7986x+0. 035相關系數(shù)r= 〇. 9995,根據(jù)回歸方程測得各種提取方法小球藻多糖的提取率如表1
[0038] 表1不同提取方法對小球藻粗多糖提取率的影響
[0039]
[0040] 4. 2根據(jù)小球藻粗多糖的質(zhì)量測得多糖回收率如表2
[0041] 表2不同提取方法小球藻多糖回收率
[0042]
[0043] 5、結論
[0044] 由表1可知，前3種方法提取的多糖提取率都相差無幾，但是經(jīng)過凍融法處理結合 超聲波提取多糖的提取率提高了 1.4倍。因此可以確定凍融法+超聲波提取為最適合提取 小球藻多糖。由于小球藻細胞壁的主要成分是纖維素與果膠，純粹的物理機械破碎的方法， 難以將所有的細胞壁進行破碎。凍融法是在~20°C冷凍、室溫緩慢融化的一種方法，是一種 比較溫和的破壁方式，可以避免高溫對原料所造成的營養(yǎng)損失等不良影響，可使細胞破裂 較為徹底細胞壁超聲波提取法是在傳統(tǒng)水提法的基礎上，輔助超聲波處理，利用超聲波產(chǎn) 生的空化作用、機械作用加速細胞壁的破碎，促進胞內(nèi)物質(zhì)的溶出從而提高了多糖提取率 且所得小球藻多糖較其他提取方法純凈度高。
[0045] 實施例2
[0046] 1、預處理：稱取200g小球藻粉溶于1000ml蒸餾水中配制成濃度為5%混懸液，置 于60°C水浴箱中Ih并不斷攪拌；
[0047] 2、凍融、超聲波處理：將小球藻混懸液，經(jīng)~20°C冷凍，室溫下解凍。重復凍融 過程4次，每次冷凍12h;后加入5mL、pH7. 0、濃度為0.Olmol/L磷酸緩沖液，超聲波處理 (500W，時間5min)，于2000r/min條件下離心5min,過濾，濾液備用；
[0048] 3、酶解濾渣：將步驟2中濾渣加蒸餾水300ml配制成15%溶液，加入胰蛋白酶 I. 5ml，酶解溫度55°C，酶解時間2h，離心，轉速控制為3500r/min，時間為lOmin，過濾，濾液 備用；
[0049] 4、減壓濃縮與醇析：將步驟2與步驟3中濾液合并減壓濃縮至130ml，加入 260ml95%的無水乙醇混合均勾，置于搖床40min;，5000r/min條件下離心IOmin,棄去上 清液，即得粗多糖；
[0050] 5、多糖純化：將粗多糖，溶入250mL蒸餾水中，用80%的三氯乙酸調(diào)節(jié)pH值為 6. 0,靜置18h，8000r/min條件下離心5min，取上清液；冷凍干燥，即得多糖。
[0051] 制得的粗多糖的質(zhì)量為11. 560g，多糖提取率為5. 78%，多糖純化率為78. 94%
[0052] 實施例3
[0053] 1、預處理：稱取50g小球藻粉溶于500ml蒸餾水中配制成濃度為10%混懸液，置 于60°C水浴箱中Ih并不斷攪拌；
[0054] 2、凍融、超聲波處理：將小球藻混懸液，經(jīng)~20°C冷凍，室溫下解凍。重復凍融過 程4次，每次冷凍12h;后加入4. 5mL、pH7. 0、濃度為0.Olmol/L磷酸緩沖液，超聲波處理 (600W，時間6min)，于2500r/min條件下離心5min,過濾，濾液備用；
[0055] 3、酶解濾渣：將步驟2中濾渣加蒸餾水IOOrnl配制成20%溶液，加入胰蛋白酶 0. 5ml，酶解溫度55°C，酶解時間2h，離心，轉速控制為4000r/min，時間為10min，過濾，濾液 備用；
[0056] 4、減壓濃縮與醇析：將步驟2與步驟3中濾液合并減壓濃縮至60ml，加入 120ml95%的無水乙醇混合均勾，置于搖床38min;，5000r/min條件下離心IOmin,棄去上 清液，即得粗多糖；
[0057] 5、多糖純化：將粗多糖，溶入250mL蒸餾水中，用80%的三氯乙酸調(diào)節(jié)pH值為 6. 0,靜置12h，8000r/min條件下離心5min，取上清液；冷凍干燥，即得多糖。
[0058] 制得的粗多糖的質(zhì)量為3. 49g，多糖提取率為6. 98%，多糖純化率為76. 96%。
【主權項】
1. 一種小球藻多糖的提取方法，其特征在于：具體操作步驟如下： 1) 、預處理：將小球藻粉加水配制成濃度為5%~10%混懸液，置于60°C水浴箱中Ih 并不斷攪拌； 2) 、凍融、超聲波處理：將小球藻混懸液，經(jīng)（一 20°C )冷凍，室溫下解凍。重復凍融過 程4次，每次冷凍12h;后加入3~5mL、pH7.0、濃度為0.0 lmol/L磷酸緩沖液，超聲波處理 (400~600W，時間4~6min)，于2000~2500r/min條件下離心5min,過濾，濾液備用； 3) 、酶解濾渣：將步驟2中濾渣加水配制成10~20%溶液，加入胰蛋白酶,酶解溫度均 為50~60°C，酶解時間2h ;離心，轉速控制為3000~4000r/min，時間為lOmin，過濾，濾液 備用； 4) 、減壓濃縮與醇析：將步驟2)與步驟3)中濾液合并混勻，減壓濃縮至濾液體積的 十分之一，即得濃縮液，加入95%的無水乙醇混合均勾，置于搖床30~45min ;，4000~ 5000r/min條件下離心10min,棄去上清液，即得粗多糖； 5) 、多糖純化：將粗多糖，溶入250mL蒸餾水中，用80%的三氯乙酸調(diào)節(jié)pH值為4.0~ 6. 0,靜置12~18h，8000r/min條件下離心5min，取上清液；冷凍干燥，即得多糖。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種小球藻多糖的提取方法，其特征在于：步驟3)中胰蛋白 酶活性為3000U/mg。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種小球藻多糖的提取方法，其特征在于：步驟3)中濾液： 胰蛋白酶重量之比為100:0. 5。4. 根據(jù)權利要求1所述的一種小球藻多糖的提取方法，其特征在于：步驟4)中濃縮 液：95%無水乙醇重量比為1:2。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小球藻多糖的提取方法，涉及海洋生物技術領域。通過交替凍融使細胞壁完全破碎，同時聯(lián)合超聲波輔助提取方法，避免了高溫對原料所造成的營養(yǎng)損失、有效成分破壞嚴重的不良影響。而且促使小球藻細胞內(nèi)多糖物質(zhì)快速溶出。與傳統(tǒng)多糖提取相比，本發(fā)明的方法具有能耗低、多糖提取率、回收率高，生產(chǎn)成本低的特點。通過本發(fā)明凍融聯(lián)合超聲波提取方法，小球藻多糖提取率、回收率分別是傳統(tǒng)提取方法的1.34～1.39倍以及1.1～1.58倍。
【IPC分類】C08B37/00
【公開號】CN105085697
【申請?zhí)枴緾N201510471285
【發(fā)明人】都寶君
【申請人】都寶君
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月5日