一種蛹蟲草活性多糖的制備方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及食用菌提取領域,具體的說涉及一種具有抗腫瘤活性的蛹蟲草多糖的 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛹蟲草(Cordycepsmilitaris),又名北冬蟲夏草,是麥角菌科蟲草屬真菌。具有 益肺腎、補精髓、止血化痰的功效,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)有延緩衰老、抗疲勞和耐缺氧,調(diào)節(jié)免疫系 統(tǒng),抗缺氧、增加心肌營養(yǎng)和血流量等多種作用。
[0003]目前市場上蛹蟲草的保健產(chǎn)品越來越多,其中多糖類成分通過提高機體免疫功達 到抗腫瘤的功效。由于目前提取方式單一,但目前對蟲草多糖的化學組成、鏈結(jié)構(gòu)、分子大 小與抗腫瘤作用之間的關系研究較少,獲得的產(chǎn)品多糖產(chǎn)品含量低、有效成分不明確,因 此,蛹蟲草多糖提取工藝與抗腫瘤活性之間的關系缺乏規(guī)律性。
[0004]目前國內(nèi)外分離純化菌類多糖大多采用粉碎,脫脂,水提,濃縮,醇沉,離心,凍干, 溶解,脫蛋白,脫色,上柱純化等步驟,工藝復雜,并需采用有機溶劑進行脫脂、脫蛋白,上柱 純化使用了一種分子篩凝膠(SephadexG-100或G-75),分離樣品需要手工收集,實驗檢測 多糖(苯酚-硫酸法),工藝路線長,生產(chǎn)效率底,產(chǎn)品成本高,難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
[0005]CN1560085A公開了 : 一種利用蟲草人工培養(yǎng)中產(chǎn)生的培養(yǎng)基下腳料提取蟲草多 糖的工藝,該法可變廢為寶,減少資源的浪費,提高經(jīng)濟效益,但是在多糖制備過程中使用 了氯仿等有機溶劑,不利于食品安全。
[0006]CN102558264A公開了:提取蛹蟲草中蟲草多糖的方法,但是,使用食用酒精、丙 酮、乙醚,工藝流暢過長。
[0007]CN101124988A公開了 : 一種從蛹蟲草中提取精制蟲草多糖的方法,為了得到精制 蛹蟲草多糖,需要使用木瓜蛋白酶脫蛋白處理,成本高。
[0008] CN101200491A公開了 :蛹蟲草子實體水溶性肽多糖的快速分離純化方法,取蛹蟲 草子實體烘干、粉碎;超純水提取得組分CFl;分子篩分離得組分CFl-I;離子交換柱分離、 純化得組分CF1-1-1與CF1-1-2;親和層析柱分離、純化得肽多糖CF1-1-1-UCF1-1-2-1與 CF1-1-2-2。
[0009]CN101805412A公開了 : 一種具有抗腫瘤活性的水溶性低分子多糖,由下法制 得:用30%乙醇作提取劑,從蟲草菌種深層發(fā)酵培養(yǎng)出的菌絲體中提取蟲草多糖,通過單 因素和正交實驗確定了古尼蟲草多糖的最佳提取工藝:溫度為70°C,料液比為1 :20,提取 時間為2小時。提取液經(jīng)去脂、去蛋白、50%、70%乙醇沉淀,冷凍干燥后得到粗多糖。經(jīng) DEAESephadexA-25柱和S印hadexG-75柱逐級純化,冷凍干燥得到一種水溶性低分子多糖 CPS-50-Al〇
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010] 本發(fā)明公開一種蛹蟲草多糖的制備方法,該方法包括如下步驟:
[0011] 蛹蟲草子實體超細粉碎后用沸水提取,收集上清液;上清液濃縮后加入乙醇沉淀, 沉淀部位過DEAE-sepharose柱,0-0. 5NNaCL的部位脫鹽后冷凍干燥獲得蛹蟲草活性多糖。
[0012] 具體的說,本發(fā)明的一種蛹蟲草提取物的制備方法,包括如下步驟:
[0013] 1、蛹蟲草原料的粉碎:以蛹蟲草子實體為原料,粉碎成粗粒,再進行超細粉碎至 300-500 目;
[0014] 2、蛹蟲草粗多糖的提?。河枷x草細粉,加入20倍重量的蒸餾水中,攪勻并加熱至 沸騰,保持微沸60-120分鐘,過濾保留濾液,棄去殘渣;
[0015] 3、蛹蟲草粗提液的濃縮:濾液用1000 OXg的速度離心30min,上清液減壓濃縮至 料液比為1:1-1:2 ;
[0016] 4、乙醇沉淀及洗滌:向上述濾液中加入無水乙醇,至乙醇含量達到40% -50%,離 心去除醇沉上清,收集沉淀,用40% -50%的乙醇洗滌沉淀6-7次;
[0017] 5、沉淀加水溶解,過DEAE-S印harose柱,先用水洗脫,再用O-IN的NaCL梯度洗 脫,收集0-0. 5NNaCL部位的多糖,濃縮,超濾脫鹽,冷凍干燥即獲得所需的近白色的蛹蟲草 多糖。
[0018] 本發(fā)明制備得到的蛹蟲草多糖得率約為0. 35%,多糖含量達到80%以上。
[0019] 本發(fā)明涉及蛹蟲草多糖提取物在制備抗腫瘤活性的組合物上應用。
[0020] 本發(fā)明涉及蛹蟲草多糖提取物在制備抗肺癌活性的組合物上應用。
[0021] 本發(fā)明涉及蛹蟲草多糖提取物的產(chǎn)品包括而不限于藥品、食品、保健食品、化妝 品,其賦形劑或載體為制藥或食品領域中常用的賦形劑或載體,如稀釋劑,崩解劑,潤滑劑 等。
[0022] 本發(fā)明涉及蛹蟲草多糖的分析方法,采用HPLC對提取物中的蛹蟲草多糖進行含 量分析。
[0023] 本發(fā)明涉及蛹蟲草多糖制劑的分析方法,采用HPLC對制劑中的蛹蟲草多糖進行 含量分析。
[0024]HPLC色譜條件:
[0025]Waters2695 高效液相色譜(Waters,USA),配備TSK-GELG6000PWXL分析 柱(7. 8mmX300mm),Waters2414 不差折光檢測器(Waters,USA),visioStar-II粘度 計(Wyatt,USA),DAWN8+激光散射儀(Wyatt,USA),waters2998光電二極管陣列檢測器 (Waters,USA).
[0026] 流動相MilliQwater(去離子水)配制緩沖液,
[0027] 用lmol/L的NaOH溶液將pH值調(diào)到7. 0,再加IOmL的lOmg/mLNaN2PO4,所配制的 溶液用0. 45ym的濾膜過濾,并用超聲或真空脫氣,得到緩沖液。
[0028]緩沖液中NaH2POjPNaNO3的濃度分別為0?lmol/L和0?3mol/L。
[0029]流速為0? 5mL/min。
[0030] 柱溫和檢測器溫度40°C。多糖樣品用流動相配成2mg/mL溶液,上樣量50yL。
[0031] 本發(fā)明涉及的蛹蟲草多糖的制備方法是一種高效、多糖含量高、顏色淺的生產(chǎn)方 法。
[0032] 本發(fā)明涉及的蛹蟲草原料包括而不限于:張家港順泰元生物科技有限公司的蛹蟲 草。
[0033] 本發(fā)明HPLC色譜條件的優(yōu)選過程:
[0034]流動相:含有 0?lmol/LNaH2POjP0? 3mol/LNaNO3的水溶液(pH至 7. 0),,
[0035] 流動相的配制方法:取Mi11iQwater(去離子水),使得NaH2POjPNaNO3的濃度 分別為〇?lmol/L和0? 3mol/L,用lmol/L的NaOH溶液將pH值調(diào)到7. 0,所配制的溶液用 0. 45ym的濾膜過濾,并用超聲或真空脫氣,得流動相。
[0036]柱溫:對室溫、30°(:、40°(:、50°(:、60°(:、70°(:和80°(:進行比較分析,40°(:效果較好, 因此選擇40°C。
[0037]流速為0? 5mL/min。
[0038] 本發(fā)明提取工藝的優(yōu)選過程:
[0039] 用HPLC分析對蛹蟲草子實體水提液中粗多糖分布,發(fā)現(xiàn)15min左右有一大分子量 單一對稱糖峰;
[0040] 用乙醇將水提液的醇濃度分別調(diào)節(jié)30 %、35 %、40 %、45 %、50 %、55 %和60 %,沉 淀后1000 Og離心30min,取沉淀,揮去乙醇,用蒸餾水溶解,結(jié)合HPLC色譜圖分析不同醇沉 濃度得到的多糖分子量分布,結(jié)果顯不,醇沉濃度為45%時,可將大分子量的單一對稱糖峰 與其它部位分尚。
[0041] 取醇沉得到的粗多糖溶液,上SepharoseFastFlow離子交換柱層析,用AKTA prime層析系統(tǒng)(AmershamBioscience),先用蒸餾水洗脫1個柱體積,再用O-INNaCl梯度 洗脫,流速4mL/min,分部收集洗脫液,每管15mL,用苯酚-硫酸法檢測糖峰,繪制曲線,得到 3個分離的糖峰,根據(jù)曲線優(yōu)化洗脫過程,縮短洗脫時間,同時3個糖峰也能有效分開,
[0042]最終優(yōu)化的洗脫程序為:SepharoseFastFlow柱(50mmX30cm),流速4ml/min,A 為INNaCL
[0043] 0 - 50min,0%A;
[0044] 50 - 75min,0% - 10%A;
[0045] 75 - 127. 5min,10%-100%A;
[0046] 127. 5 - 157. 5min,:100%A
[0047] 10-35min為第一個糖峰,50-70min為第二個糖峰,75-90min為第三個糖峰(見圖 1),分別命名為Pl、P2、P3,三個糖峰,分別濃縮,透析,冷凍干燥,測定得率、糖含量和體外 免疫活性。經(jīng)體免疫細胞活性測定Pl沒有免疫活性,P2和P3有活性,但P3得率低,僅為 0. 16 %,多糖含量為37. 9 %,P3雖然有活性但得率和糖含量低于P2很多。
【附圖說明】
[0048] 圖I:DEAE_S印harose洗脫后有三個糖峰
[0049] 圖2 :本發(fā)明的蛹蟲草多糖的示差檢測呈現(xiàn)單一對稱峰
[0050] 本發(fā)明制備工藝的優(yōu)勢:
[0051] 1.工藝簡單:采用水之后的乙醇沉淀物上層析柱分離純化,省略了常規(guī)提取中的 脫脂、己醇沉淀、脫蛋白和脫色的步驟,簡化工藝。
[0052] 2.綠色分離,常規(guī)工藝中一般均需采用乙醚或石油醚脫脂,乙醇沉淀多糖和蛋白 質(zhì),再用氯仿丁醇或戊醇的Sevag法,三氟三氯乙烷法或三氯醋酸法脫蛋白,然后用活性炭 吸附法或雙氧水氧化脫色;而本發(fā)明不使用丙酮、乙醚,由于乙醇能回收使用,因此,本發(fā)明 屬于綠色分離。
[0053] 3.效率高:省去了脫脂、乙醇沉淀、脫蛋白和脫色等步驟,。
[0054] 4.成本低,本發(fā)明沒有使用分子篩凝膠柱、親和層析柱,僅僅使用離子交換柱 DEAE-sepharose,就能得到的近白色的蛹蟲草多糖。
[0055] 5.產(chǎn)品純度高:本發(fā)明的蛹蟲草多糖的示差檢測呈現(xiàn)單一對稱峰(見附圖2)。
【具體實施方式】:
[0056] 實施例1 :
[0057] 1、蛹蟲草原料的粉碎:蛹蟲草子實體5Kg,粉碎機粉碎成粗粒,再用超細粉碎機進 行超細粉碎至300目備用;
[0058] 2、蛹蟲草的提?。悍Q取超細粉碎的蛹蟲草lKg,加入50000mL蒸餾水,加熱至沸騰, 保持微沸120分鐘,1000 Og離心30min,取上清液合并;
[0059] 3、蛹蟲草粗提液的濃縮:上清液減壓濃縮至料液比為1:1 ;
[0060] 4、乙醇沉淀及洗滌:向上述濃縮液中加入無水乙醇,至乙醇含量達到40% -50%, 離心去除醇沉上清,收集沉淀,用50%的乙醇洗滌沉淀3次;
[0061] 5、沉淀Ig加IOOmL水溶解,過IL的DEAE-sepharose柱,先用1-2個柱體積的水 洗脫后,用O-IN的NaCL梯度洗脫2個柱體積,收集0