一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液、其應(yīng)用及凍存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液、其應(yīng)用及凍存 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells,iPScells)最初是日本人 山中申彌（ShinyaYamanaka)于2006年利用病毒載體將四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（0ct4，Sox2，Klf4 和c-Myc)的組合轉(zhuǎn)入分化的體細(xì)胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞 類型。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能夠通過(guò)向體細(xì)胞中導(dǎo)入誘導(dǎo)基因，使體細(xì)胞重編程獲得具有胚胎 干細(xì)胞樣特性的多能干細(xì)胞，也稱為去分化。
[0003] 隨后世界各地不同科學(xué)家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他方法同樣也可以制造這種細(xì)胞。成功建立 iPS細(xì)胞后，應(yīng)用iPS細(xì)胞來(lái)治療疾病是人們的最終目標(biāo)。iPS細(xì)胞不僅可用于分化和移 植，還可以提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機(jī)制、篩選新藥以及開(kāi)發(fā)新的治療 方法。在體外，iPS細(xì)胞可定向誘導(dǎo)分化出多種細(xì)胞，比如神經(jīng)干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞、心肌干 細(xì)胞等，因此，iPS細(xì)胞在理論研究和臨床應(yīng)用等方面都極具應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 細(xì)胞凍存是細(xì)胞長(zhǎng)期保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于_196°C液氮 中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候 再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染 或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。
[0005] 細(xì)胞凍存過(guò)程會(huì)顯著改變細(xì)胞的熱力學(xué)、化學(xué)和物理環(huán)境，有伴隨造成生物性損 傷的危險(xiǎn)。為了將細(xì)胞凍存、復(fù)蘇過(guò)程中細(xì)胞的損傷降至最低，必須進(jìn)一步優(yōu)化化學(xué)和溫度 操作過(guò)程，但需要在凍存前加入一種或一種以上的凍存保護(hù)劑，在溶解后又將其去除。目前 最常用的凍存保護(hù)劑為二甲基亞砜（DMSO)，這種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可 以使冰點(diǎn)下降，減少胞內(nèi)形成冰晶的機(jī)會(huì)，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。由于高濃度DMSO 對(duì)細(xì)胞有毒性，還必須添加其他的液體成分，如血清、細(xì)胞培養(yǎng)基，以降低DMSO的濃度，減 少對(duì)細(xì)胞的傷害。
[0006] 目前，iPS細(xì)胞凍存液多采用為培養(yǎng)基配合胎牛血清及DMS0。但是胎牛血清源于 動(dòng)物，可能會(huì)含有一些動(dòng)物源性病原體，這使iPS細(xì)胞應(yīng)用于臨床具有很大的風(fēng)險(xiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液、其應(yīng)用及凍存方 法。本發(fā)明的iPS細(xì)胞凍存液不采用動(dòng)物血清免了血清傳播動(dòng)物源性病原體的風(fēng)險(xiǎn)，確保 iPS細(xì)胞超低溫凍存的安全性。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液，以頂DM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基質(zhì)，每 IOOmL誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液中包括以下體積濃度的組分：
[0010] 2 ~20v/v%DMSO;
[0011] 0? 5 ~5v/v% 右旋糖酐 40 ;
[0012] 0? 5~5v/v%白蛋白；
[0013]Ing~1000 ngThiazovivin;
[0014] 余量為頂DM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0015] 本發(fā)明摒棄用動(dòng)物血清作為凍存液成分之一，而是采用了安全性較好的右旋糖苷 40、白蛋白及Thiazovivin，并聯(lián)合DMS0,用于凍存iPS細(xì)胞，既避免了傳播潛在病原體的風(fēng) 險(xiǎn)，提高了細(xì)胞凍存的安全性，而且還確保了細(xì)胞的凍存效果。iPS細(xì)胞復(fù)蘇后具有較高的 活率，因此在臨床上具有很大的使用價(jià)值。
[0016] 在本發(fā)明中，以頂DM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基質(zhì)，右旋糖苷40、白蛋白、Thiazovivin 及DMSO通過(guò)復(fù)合作用，可以達(dá)到較好的凍存iPS細(xì)胞的效果。其中Thiazovivin為一種 ROCK抑制劑，所述白蛋白優(yōu)選為人學(xué)白蛋白。
[0017] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，以頂DM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基質(zhì)，每IOOmL誘導(dǎo) 多能干細(xì)胞凍存液中包括以下體積濃度的組分：
[0018] 2 ~20v/v%DMSO;
[0019] 0?5 ~5v/v% 右旋糖酐 40;
[0020]0? 5~5v/v%白蛋白；
[0021] Ing~1000 ngThiazovivin;
[0022] 余量為頂DM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0023] 作為優(yōu)選的方案，包括：3~10v/v%DMS0。
[0024] 作為優(yōu)選的方案，包括：0?5~5v/v%右旋糖酐40。
[0025] 作為優(yōu)選的方案，包括：0? 6~3v/v%白蛋白。
[0026] 作為優(yōu)選的方案，包括：1.Ing~IOOngThiazovivin0
[0027] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，每IOOmL誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液中包括以下體 積濃度的組分：
[0028]
[0029] 本發(fā)明還提供了所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液在凍存誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的凍存方法，用所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存 液凍存所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
[0031] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，凍存方法包括如下步驟：
[0032] 將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞懸液離心，去上清，然后與上述技術(shù)方案所述的誘導(dǎo)多能干細(xì) 胞凍存液混合，分裝，凍存。
[0033] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，凍存方法具體為：將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞懸液 1500rmp離心5min，離心結(jié)束后，去上清后，緩慢加入所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液，輕輕吹 打混勻后，分裝，凍存。分裝的凍存液每管為I. 5mL，放入-80°C冰箱中過(guò)夜，次日移入液氮 罐。作為優(yōu)選的方案，所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的凍存密度為1~10X106/mL。
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液不采用動(dòng)物血清，避免了血清 傳播動(dòng)物源性病原體的風(fēng)險(xiǎn)。而且，采用本發(fā)明的凍存液，細(xì)胞復(fù)蘇后活率更高，顯示其更 好的凍存效果。凍存3個(gè)月后，用本發(fā)明凍存液凍存的iPS細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞活率為91 %以 上，顯著（P< 0. 05)高于用傳統(tǒng)凍存液（培養(yǎng)基+胎牛血清+DMS0)的凍存效果。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1示采用凍存液A的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后的顯微圖片；
[0036] 圖2示采用凍存液B的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后的顯微圖片；

【具體實(shí)施方式】
[0038] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，但是 應(yīng)當(dāng)理解，這些描述只是為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，而不是對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的 限制。
[0039] 本發(fā)明提供的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液、其應(yīng)用及凍存方法中所用原料及試劑均可 由市場(chǎng)購(gòu)得。
[0040] 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可由市場(chǎng)購(gòu)得。
[0041] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0042] 實(shí)施例1
[0043] 右旋糖酐40原料為6%右旋糖酐40-氯化鈉注射液（國(guó)森藥業(yè)）。
[0044] IOugThiazovivin(美國(guó) StemRD公司）用 ImlDMSO溶解，配成1000倍的 Thiazovivin儲(chǔ)存液。
[0045] 在68. 23mlDMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入16. 67ml右旋糖酐40注射液、5ml白蛋白 注射液、IOOulThiazovivin儲(chǔ)存液，混勻；之后緩慢加入IOmlDMSO溶液，混勾，置于4度 冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0046] 實(shí)施例2
[0047] 右旋糖酐40原料為6%右旋糖酐40-氯化鈉注射液（國(guó)森藥業(yè)）。
[0048]IOugThiazovivin(美國(guó)StemRD公司）用ImlDMSO溶解，配成1000倍的 Thiazovivin儲(chǔ)存液。
[0049] 在69. 155mlDME