M/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入8. 335ml右旋糖酐40注射液、2. 5ml白 蛋白注射液、IOulThiazovivin儲(chǔ)存液，混勻；之后緩慢加入20mlDMSO溶液，混勻，置于4 度冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0050]實(shí)施例3
[0051] 右旋糖酐40原料為6%右旋糖酐40-氯化鈉注射液（國(guó)森藥業(yè)）。
[0052] IOugThiazovivin(美國(guó) StemRD公司）用 ImlDMSO溶解，配成1000倍的 Thiazovivin儲(chǔ)存液。
[0053] 在29.66mlDMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入33. 34ml右旋糖酐40注射液、25ml白蛋 白注射液、IOmlThiazovivin儲(chǔ)存液，混勻；之后緩慢加入2mlDMSO溶液，混勻，置于4度 冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0054] 實(shí)施例4
[0055] I.iPS細(xì)胞的凍存
[0056] 將IPS細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，取20yL細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，離 心管配平后置于離心機(jī)內(nèi)，1500rpm離心5min。
[0057] 離心結(jié)束后，倒掉離心上清，用IOmL-次性移液管緩慢地加入凍存液。根據(jù)細(xì)胞 計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算得出凍存液用量，凍存密度1乂106(^11/1^，每管1.51^。
[0058] 邊添凍存液加邊旋轉(zhuǎn)離心管，輕輕吹打混勻后，分裝到凍存管中。
[0059] 標(biāo)記凍存管，從冰箱中取出凍存盒，將凍存管置于凍存盒內(nèi)，將凍存盒放傳遞窗內(nèi) 放入超低溫冰箱（-80°C)中。
[0060] 本實(shí)施例中選用的凍存液分別為凍存液1和凍存液2。
[0061] 凍存液A為實(shí)施例1中得到的凍存液和傳統(tǒng)配方的凍存液。凍存液B為傳統(tǒng)配方 的凍存液，即DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%DMS0+20%FBS。
[0062] 2.iPS細(xì)胞的復(fù)蘇
[0063] 2. 1把將要復(fù)蘇的IPS細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速用鑷子夾住并放入已預(yù)熱至 37°C水浴鍋中，來回?fù)u晃使細(xì)胞懸液盡快溶解后將凍存管從凍存室的傳遞窗傳進(jìn)去。
[0064] 2. 2用巴氏吸管迅速將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移50mL離心管中，用IOmL-次性移液管吸取 15mLDMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基緩慢加入到50mL離心管中，邊添加邊旋轉(zhuǎn)離心管，輕輕吹打混 勻。
[0065] 2. 3用手動(dòng)移液槍取20uL細(xì)胞懸液至EP管中進(jìn)行計(jì)數(shù)，其余液體用50mL離心管 配平后置于離心機(jī)內(nèi)，1500rpm離心5min。
[0066] 2. 4根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，用PSGro完全培養(yǎng)基（美國(guó)StemRD公司）調(diào)整細(xì)胞接種 密度為7X104-8X104cell/ml，根據(jù)細(xì)胞總量選擇接種培養(yǎng)皿規(guī)格及數(shù)量。
[0067] 2. 5IOcm培養(yǎng)皿接種步驟：接種細(xì)胞總量為7-8XIO5ceIl,用IOmL-次性移液管 接種IOmL的細(xì)胞懸液至培養(yǎng)皿中，每皿添加100yL的Iyg/mLEGF;15cm培養(yǎng)皿接種步 驟：接種細(xì)胞總量為14-16XIO5ceIl，用25mL-次性移液管接種20mL的細(xì)胞懸液至培養(yǎng)皿 中
[0068] 2. 6在培養(yǎng)皿蓋上方做好標(biāo)記（條形碼、代數(shù)、批次、操作人、日期），轉(zhuǎn)移至5% C02、37 °C、飽和濕度為95 %的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0069] 取6XIO6IPS細(xì)胞，分成6管，離心去除上清后，3管用凍存液1凍存，余3管用凍 存液2凍存，凍存方法為本發(fā)明實(shí)施例4,凍存3個(gè)月后，參照實(shí)施例4的方法進(jìn)行復(fù)蘇，計(jì) 算各管細(xì)胞活率，并進(jìn)行培養(yǎng)，比較細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖速度。
[0070] 表1凍存3個(gè)月后，用本發(fā)明凍存液凍存的iPS細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞活率
[0071]
[0072] 由表1可見，iPS細(xì)胞復(fù)蘇后的活率比較，凍存液A凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后的活率明顯 高于凍存液B(P〈0.05)。
[0073] 圖1和圖2為細(xì)胞復(fù)蘇后的培養(yǎng)照片，圖1為采用凍存液A的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后的顯 微圖片，圖2為采用凍存液B的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后的顯微圖片，顯示采用凍存液A后復(fù)蘇的細(xì)胞 匯合度高于采用凍存液B后復(fù)蘇的細(xì)胞。
[0074] 表2采用本發(fā)明凍存液及傳統(tǒng)凍存液的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后的增殖速度比較
[0075]
[0076] 表2中，*P〈0. 05,與傳統(tǒng)方法相比，采用本發(fā)明凍存液的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后的增殖速 度顯著高于采用傳統(tǒng)方法凍存液的細(xì)胞復(fù)蘇后的增殖速度。
[0078] 以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì) 于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行 若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0079] 對(duì)所公開的實(shí)施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。 對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的 一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明 將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一 致的最寬的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液，以頂DM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基質(zhì)，每lOOmL誘導(dǎo)多能干 細(xì)胞凍存液中包括以下體積濃度的組分： 2 ~20v/v%DMS0 ; 0.5~5v/v%右旋糖酐40; 0. 5~5v/v%白蛋白； lng ~ lOOOng Thiazovivin； 余量為IMDM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液，其特征在于，包括：3~10v/v% DMS0。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液，其特征在于，包括：0. 5~5v/v%右 旋糖酐40。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液，其特征在于，包括：0. 6~3v/v%白 蛋白。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液，其特征在于，包括：1.lng~100ng Thiazovivin。6. 根據(jù)權(quán)利要求1任意一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液，其特征在于，每100mL誘導(dǎo) 多能干細(xì)胞凍存液中包括以下體積濃度的組分： DMSO 10%: 右旋糖酐40 1%; 白蛋白 1%; Thiazovivin1Ong: IMDM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 68.23mL。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液在凍存誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中 的應(yīng)用。8. -種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的凍存方法，其特征在于，用如權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)所述的 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液凍存所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的凍存方法，其特征在于，包括如下步驟： 將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞懸液離心，去上清，然后與權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)多能 干細(xì)胞凍存液混合，分裝，凍存。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的凍存方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的凍存密度為 1 ~10X106/mL〇
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域。本發(fā)明夠提供了一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液，其應(yīng)用及凍存方法。本發(fā)明的凍存液以IMDM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基質(zhì)，每100mL誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存液中包括以下體積濃度的組分：2～20v/v％DMSO；0.5～5v/v％右旋糖酐40；0.5～5v/v％白蛋白；1ng～1000ng？Thiazovivin；余量為IMDM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述凍存液不采用動(dòng)物血清，避免了血清傳播動(dòng)物源性病原體的風(fēng)險(xiǎn)。而且，采用本發(fā)明的凍存液，凍存效果更好，細(xì)胞復(fù)蘇后活率更高。凍存3個(gè)月后，用本發(fā)明凍存液凍存的iPS細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞活率為91％以上，顯著高于用傳統(tǒng)凍存液的凍存效果。
【IPC分類】C12N5/0735
【公開號(hào)】CN105087472
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510261052
【發(fā)明人】王一飛, 陳海佳, 葛嘯虎, 盧瑞珊, 王小燕, 李平
【申請(qǐng)人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年5月20日