無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞在單純的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不能存活，在細(xì)胞培養(yǎng)中必須提供某些痕量營養(yǎng)物 質(zhì)及生長(zhǎng)因子才能使細(xì)胞得以生長(zhǎng)并維持生長(zhǎng)狀態(tài)。因此采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基常常要添加血 清，如馬血清或胎牛血清；因?yàn)檠迨怯珊芏啻笮〔煌锓肿咏M成的極為復(fù)雜的混合物， 它能提供細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)所需要的生長(zhǎng)因子、激素、結(jié)合蛋白，并提供保護(hù)作用；而且本 身血清中還富含有絲分裂因子，也利于細(xì)胞系和原代培養(yǎng)。但血清培養(yǎng)基存在一定的弊端， 無法規(guī)避動(dòng)物血清中的異源體，如果使用動(dòng)物血清培養(yǎng)基培育出來的細(xì)胞，會(huì)存在人體異 源體排斥和沖突。
[0003] 尤其是在干細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，血清中大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)，給細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo) 準(zhǔn)化帶來困難，其中復(fù)雜的蛋白和多重的細(xì)胞因子，會(huì)導(dǎo)致本身就容易分化的干細(xì)胞生出 多種完全不同的細(xì)胞表型，而產(chǎn)生多種完全不同的細(xì)胞分化趨勢(shì)，也給細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)品 分離純化和結(jié)果的重復(fù)性帶來很大的困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明實(shí)施的目的在于克服血清培養(yǎng)基的缺陷，提供一種無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基及 其應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0006] -種無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的補(bǔ)充因 子，所述補(bǔ)充因子包括亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白、胰島素、纖粘連蛋白和氫化可的 松。
[0007] 本發(fā)明還提出將上述無血清培養(yǎng)基進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用。
[0008] 采用本發(fā)明的上述無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，針對(duì)干細(xì)胞自身容易生出多種完全不同 的細(xì)胞表型和多種完全不同的細(xì)胞分化趨勢(shì)的情形，采用上述各功能成分穩(wěn)定和保持其分 化水平，并且將其中的生長(zhǎng)因子盡量控制保持在單一的水平；并且可以避免現(xiàn)有技術(shù)血清 蛋白培養(yǎng)基存在的血清批次間的質(zhì)量差異，提高細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性；并避免血 清所帶來的外源性污染及血清組分的細(xì)胞毒性作用。并且其自身成分相對(duì)明確、質(zhì)量一致 且蛋白含量低，有利于提高細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。同時(shí)，在上述幾 種特定搭配維持干細(xì)胞增殖和性狀程度后，可通過延長(zhǎng)細(xì)胞的GI期或迫使細(xì)胞處于GO期 而較長(zhǎng)時(shí)間的維持細(xì)胞高密度培養(yǎng)，能更好地保持其干細(xì)胞特性。
【附圖說明】
[0009] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0010] 圖1為本發(fā)明采用血清培養(yǎng)基培養(yǎng)干細(xì)胞至第4天時(shí)顯微鏡觀察結(jié)果；
[0011] 圖2為本發(fā)明無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)干細(xì)胞至第4天時(shí)顯微鏡觀察結(jié)果；
[0012] 圖3為本發(fā)明采用血清培養(yǎng)基培養(yǎng)干細(xì)胞至第14天時(shí)顯微鏡觀察結(jié)果；
[0013] 圖4為本發(fā)明無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)干細(xì)胞至第14天時(shí)顯微鏡觀察結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0015] 本發(fā)明實(shí)例提出一種無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，和添加在基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中的補(bǔ)充因子，補(bǔ)充因子包括亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白、胰島素、纖粘連蛋白和 氫化可的松。
[0016] 本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基針對(duì)干細(xì)胞培養(yǎng)中自身容易生出多種完全不同的細(xì)胞表 型和多種完全不同的細(xì)胞分化趨勢(shì)的情形，采用上述各功能成分穩(wěn)定和保持其分化水平， 并且將其中的生長(zhǎng)因子盡量控制保持在單一的水平，并且可以避免現(xiàn)有技術(shù)血清蛋白培養(yǎng) 基存在的血清批次間的質(zhì)量差異，提高細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。
[0017] 通常在干細(xì)胞的血清培養(yǎng)中，血清中具有較多天然成分，自身可以中和細(xì)胞毒素 保護(hù)細(xì)胞，而無血清培養(yǎng)基首先需要解除毒素物質(zhì)對(duì)干細(xì)胞的傷害；干細(xì)胞培養(yǎng)的過程中， 過氧化氫是細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆的主要毒性物質(zhì)，可由培養(yǎng)基中的酪氨酸、色氨酸、核黃素、抗 壞血酸鹽等產(chǎn)生，引起細(xì)胞膜上的飽和脂肪酸、細(xì)胞蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷而導(dǎo)致細(xì)胞死 亡。本發(fā)明上述亞硒酸鈉，其中含有的微量元素硒參與谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物歧 化酶的作用過程，可以促進(jìn)氫過氧化物代謝，消除氧化物酶和氧自由基對(duì)細(xì)胞的傷害。
[0018] 另一方面，轉(zhuǎn)鐵蛋白的添加之后，其與哺乳動(dòng)物細(xì)胞上存在特定的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 結(jié)合，形成的受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物是細(xì)胞獲取必需的微量元素鐵的主要來源，此外，轉(zhuǎn)鐵 蛋白還具有生長(zhǎng)因子的性質(zhì)并能與其他微量元素如釩等結(jié)合。
[0019] 牛血清白蛋白是無血清培養(yǎng)基的主要添加生長(zhǎng)因子，它可以通過與維生素、脂類、 激素、金屬離子和生長(zhǎng)因子的結(jié)合而穩(wěn)定和調(diào)節(jié)上述物質(zhì)在無血清培養(yǎng)基中的活性；并且 牛血清白蛋白比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，調(diào)節(jié)滲透壓，并保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷等作 用，此外還有結(jié)合毒素和減輕蛋白酶對(duì)細(xì)胞影響的作用，因此加入牛血清白蛋白，以達(dá)到保 護(hù)和穩(wěn)定細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
[0020] 胰島素本身的是血糖調(diào)節(jié)激素，專用至培養(yǎng)基中之后，能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和 氨基酸的效率，從而提升RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑制細(xì)胞凋亡，是比較重要的細(xì)胞存 活因子。
[0021] 相對(duì)于胰島素，氫化可的松也是激素，是一種糖皮質(zhì)激素，具有免疫抑制作用、抗 毒作用、抗休克及一定的鹽皮質(zhì)激素活性等；用在細(xì)胞培養(yǎng)基中，首先可以免疫抑制和抗毒 作用，可以避免細(xì)胞進(jìn)一步自身抗毒和免疫反應(yīng)，從而降低了細(xì)胞自身產(chǎn)生性狀變異和分 化的情形。并且，其激素本身的功能是可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)過程中生長(zhǎng)和 增殖的速度。
[0022] 最后在無血清培養(yǎng)基中還添加纖粘連蛋白，干細(xì)胞多是來自于中胚層細(xì)胞，必須 貼壁才能生長(zhǎng)，這種情況下無血清培養(yǎng)基中要添加促貼壁和擴(kuò)展因子，同時(shí)又不誘導(dǎo)細(xì)胞 產(chǎn)生纖維化貼壁的誘導(dǎo)，所以采用添加纖粘連蛋白進(jìn)行。纖粘連蛋白其本身是一種細(xì)胞外 基質(zhì)，通過細(xì)胞外基質(zhì)改變細(xì)胞表面的粘附性促使其貼壁；并且纖粘連蛋白還是重要的分 裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，遏制干細(xì)胞發(fā)生多向性的分化。
[0023] 本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基，其針對(duì)干細(xì)胞自身來自于中胚層、且細(xì)胞易發(fā)生分化的 特性，采用有限數(shù)量的特定成分和功能的添加劑保證干細(xì)胞的基本生長(zhǎng)要求，以避免干細(xì) 胞受到多種復(fù)雜的蛋白和多重細(xì)胞因子誘導(dǎo)出現(xiàn)多種性狀和分化趨勢(shì)的問題。同時(shí)，通過 胰島素和氫化可的松的細(xì)胞激素聯(lián)合蛋白和無機(jī)鹽，補(bǔ)充在基礎(chǔ)培養(yǎng)中，使無血清培養(yǎng)基 能滿足促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖效率的同時(shí)，并維持干細(xì)胞的分化程度和性狀穩(wěn)定。
[0024] 進(jìn)一步，在上述實(shí)施方式中，激素類型的成分胰島素和氫化可的松在本發(fā)明中需 要控制其添加的量的范圍要比較窄，因?yàn)檫@兩種是生長(zhǎng)激素類的功能物質(zhì)，其本身是一些 特定功能細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，如果大量添加那么會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞向相應(yīng)類型的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)和 分化，所以這一種情形中控制其量使其滿足促進(jìn)生長(zhǎng)而避免誘導(dǎo)的發(fā)生，添加在基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中之后，調(diào)節(jié)胰島素的濃度9~11yg/ml、氫化可的松調(diào)整為10 5~10 6mol/L的濃度。
[0025] 并且，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白是血漿中主要的含鐵蛋白質(zhì)，基于本發(fā)明中作為結(jié)核性供鐵 和調(diào)節(jié)的功能，轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度的80~100yg/ml;在經(jīng)過試驗(yàn)和觀察后，轉(zhuǎn)鐵蛋白這一成分 還可以搭配"檸檬酸鐵、二甲腫酸鐵、葡糖酸鐵"這幾種機(jī)結(jié)合性的鐵鹽，功能狀態(tài)的鐵可以 輔助補(bǔ)充形成的結(jié)合復(fù)合體的來源。
[0026] 而亞硒酸鈉作為微量元素的補(bǔ)充，基本上控制其代謝能滿足消除氧自由基的和氧 化物酶的濃度即可，基本上達(dá)到8~lOmg/ml大致上就已經(jīng)能滿足培養(yǎng)基的要求了。
[0027] 而牛血清白蛋白的添加不能過于大量，雖然其是無血清培養(yǎng)基的主要添加生長(zhǎng)因 子，但是首先本身是大蛋白，對(duì)培養(yǎng)液的粘性影響比加大，大量添加的話容易加深培養(yǎng)基的 粘滯力，不利于養(yǎng)料和流動(dòng)和細(xì)胞的增殖擴(kuò)散；并且其大量蛋白大量添加，會(huì)影響細(xì)胞的各 項(xiàng)代謝；所以基本上按照干細(xì)胞的代謝環(huán)境要求，經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)和研究之后控制〇. 8~ I. 2mg/ml的終濃度即可。而相對(duì)于牛血清蛋白，纖粘連蛋白基本上控制30~40ng/ml即 可。
[0028] 同時(shí)，在滿足上述功能成分之后，基于本發(fā)明干細(xì)胞培養(yǎng)的要求，不需要在額外添 加其他的生長(zhǎng)因子成分和促進(jìn)成分，以避免不同的生長(zhǎng)促進(jìn)導(dǎo)致干細(xì)胞發(fā)身邊多樣性的性 狀產(chǎn)生趨勢(shì)。
[0029] 基于針對(duì)干細(xì)胞培養(yǎng)的效果要求，本發(fā)明的上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選采用頂EM培養(yǎng) 基；頂EM培養(yǎng)基是合成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，相比加多了幾種氨基酸的量，其他的成分相比低了 一些。雖然維持細(xì)胞代謝能力、并保證細(xì)胞不死的能力不如DEME等培養(yǎng)基，但是其自身基 本上不促進(jìn)增殖，不如其他的DEME等培養(yǎng)基，用于本發(fā)明中正好可以避免與添加的補(bǔ)充因 子產(chǎn)生多向性的增殖誘導(dǎo)。
[0030] 同時(shí)，在實(shí)施的過程中為了避免干細(xì)胞體外培養(yǎng)中的其他雜菌污染，在上述無血 清培養(yǎng)基中還可以添加雙抗，即80~lOOU/ml的青霉素及80~lOOmg/ml的鏈霉素。
[0031 ] 本發(fā)明在上述無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，還提出上述無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基在 干細(xì)胞體外培養(yǎng)或者是定向