誘導(dǎo)培養(yǎng)上的應(yīng)用。采用本發(fā)明的上述無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng) 用時，其相對現(xiàn)有技術(shù)血清培養(yǎng)基是可以避免血清批次間的質(zhì)量差異，提高細(xì)胞培養(yǎng)和試 驗結(jié)果的重復(fù)性；并避免血清所帶來的外源性污染及血清組分的細(xì)胞毒性作用。并且其自 身成分相對明確、質(zhì)量一致且蛋白含量低，有利于提高細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性并使細(xì)胞產(chǎn) 品易于純化。同時，在上述幾種特定搭配維持干細(xì)胞增殖和性狀程度后，可通過延長細(xì)胞的 GI期或迫使細(xì)胞處于GO期而較長時間的維持細(xì)胞高密度培養(yǎng)，能更好地保持其干細(xì)胞特 性。
[0032] 為使本發(fā)明的上述實施的技術(shù)細(xì)節(jié)和過程方法能更易于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解 和實施參考，同時凸顯出本發(fā)明無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基的性能和品質(zhì)，以下通過具體的實施 例進(jìn)行舉例說明。
[0033] 實施例1
[0034] S10,配置本發(fā)明的上述無血清培養(yǎng)基，具體的量比配方為：
[0035] 以頂EM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并且向其中添加上述補充因子成分，并最終控制 頂EM培養(yǎng)基中各項補充因子的濃度分別為含轉(zhuǎn)鐵蛋白100yg/ml(混合添加有Img的檸檬 酸鐵）、亞硒酸鈉l〇mg/ml、牛血清白蛋白lmg/ml、胰島素10yg/ml、纖粘連蛋白40ng/ml、氫 化可的松10 6mol/L、青霉素lOOU/ml及鏈霉素lOOmg/ml;
[0036] 配置完成之后置于培養(yǎng)瓶（25ml)中保存?zhèn)溆谩?br>[0037]S20,制備MSCs:將來源于人骸關(guān)節(jié)手術(shù)或下肢骨開放性手術(shù)時收集的骨髓標(biāo)本 (肝素抗凝處理）；其中，標(biāo)本提供者中男性3人，女性2人，年齡最大者50歲，最小者28歲。 每份標(biāo)本按1 :2的比例加在密度為I. 073g/ml的pereoll分離液上2300rpm離心30min， 取中層單核細(xì)胞，加入消毒PBS緩沖液，1000 rpm離心10min，洗滌3次，棄上清液之后所得 到的細(xì)胞體即為骨髓MSCs;
[0038] 然后將所得MSCs在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整至1X107培養(yǎng)瓶（25ml)密度用于 細(xì)胞培養(yǎng)，這里的培養(yǎng)瓶為步驟SlO中制備的含有無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶。
[0039]S30,將步驟S20接種有骨髓MSCs的無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02、 95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，3天后進(jìn)行首次 換液（采用半量換液）。7天后，細(xì)胞大部分貼壁時全量換液，此后每2~3天換液一次，直 至細(xì)胞生長到幾乎完全融合，
[0040] S40,將步驟S30中培養(yǎng)至融合的MSCs再次傳下一代培養(yǎng)：步驟S30的MSCs擴增 至細(xì)胞生長到幾乎完全融合時傾去舊培養(yǎng)基，然后用PBS液漂洗2~3次后，加入0. 25 %的 胰蛋白酶（內(nèi)含〇. 02%EDTA)，加入量以使胰蛋白酶可以完全覆蓋瓶底的細(xì)胞為準(zhǔn)。將培 養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察，見胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，加入自制的無血清培養(yǎng)基，終 止消化，吸管順序輕輕吹打瓶底，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞完全脫壁后，按1:2~1:3比例傳 代接種于25ml培養(yǎng)瓶，放置于37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至細(xì)胞生長到幾 乎完全融合時，再次進(jìn)行傳代；每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。
[0041] 同時，為了進(jìn)行對比驗證本發(fā)明的上述無血清培養(yǎng)干細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果，在上述 步驟實施的過程中，同時采用血清培養(yǎng)基作為對照組進(jìn)行對比，其中血清培養(yǎng)基采用：含 10%胎牛血清、10 6111〇1/1的氫化可的松、1001]/1111的青霉素及1001^/1111鏈霉素的低糖01^1 培養(yǎng)基。
[0042] 然后，同樣按照上述步驟，在培養(yǎng)的過程中每日用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生 長情況。
[0043] 其中，用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基和有血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)至第4天和第14天時的 照片如圖1-4,圖1為血清培養(yǎng)基培養(yǎng)至第4天時顯微鏡拍照的照片，圖2為本發(fā)明無血清 培養(yǎng)基培養(yǎng)至第4天時顯微鏡拍照的照片；圖3為血清培養(yǎng)基培養(yǎng)至第14天時顯微鏡拍照 的照片，圖4為本發(fā)明無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)至第14天時顯微鏡拍照的照片。
[0044] 從上述的圖中可以看出，在培養(yǎng)的時間較短內(nèi)，通常血清培養(yǎng)基和本發(fā)明的培養(yǎng) 基培養(yǎng)的差異不大，細(xì)胞的數(shù)量多不是很多，形態(tài)上血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)更加多樣 和復(fù)雜；但是到培養(yǎng)時間更長至14天的拍照結(jié)果，本發(fā)明圖4中培養(yǎng)的細(xì)胞的排布基本上 致密均一，形態(tài)基本上趨于相同；而圖3的血清培養(yǎng)基，細(xì)胞之間的間距和稀松度比圖4大， 而且細(xì)胞的排列的方式上稍顯雜論，這個也是因為細(xì)胞的形態(tài)均一性不如圖4所造成的。
[0045] 同時，進(jìn)一步為了驗證所培養(yǎng)的干細(xì)胞的表型和品質(zhì)，進(jìn)行如下驗證試驗：
[0046] (I)MSCs法繪制生長曲線：
[0047] 取5塊96孔板，每塊96孔板以5XIO3/孔的密度將有血清培養(yǎng)組及無血清培養(yǎng) 組的第3代細(xì)胞各接種于5個孔中，有血清培養(yǎng)組每孔加入含10%胎牛血清的低糖DMEM液 200y1，無血清培養(yǎng)組每孔加入自制無血清培養(yǎng)基200y1，在另外沒有細(xì)胞的孔中分別只 加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基和自制無血清培養(yǎng)基各200yL作為空白對照，各 5孔，置于37°C、％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗孔和對照孔每三天換液一次。
[0048] 此后每天同一時間，隨機抽取一板，測定光吸收（OD)值。測量時每孔加入MTT溶 液（5mg/ml) 20yL，繼續(xù)在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時后，小心吸棄孔內(nèi)液體，每孔 內(nèi)加入150yL的DMS0。將96孔板放置在酶聯(lián)免疫檢測儀上震蕩20分鐘，采用雙波長測定 法，酶聯(lián)免疫測定儀設(shè)定檢測波長492nm，參比波長630nm，測定OD值。檢測OD值的結(jié)果 如下：
[0049]
[0050] (2)細(xì)胞周期檢測流式細(xì)胞術(shù)分析G0/G1期、G2/M期細(xì)胞百分比。其結(jié)果如下：
[0051]
[0052] 從上表的結(jié)果中可以看出，血清培養(yǎng)組G0/G1期、G2/M期細(xì)胞百分比分別平均為 39. 93%、33. 43 %，無血清培養(yǎng)組分別平均為71. 35 %、10. 1 %。從對比的結(jié)果，本發(fā)明的無 血清培養(yǎng)基培養(yǎng)成分相對明確、質(zhì)量一致且蛋白含量低，有利于提高細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定 性并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。而且可通過延長細(xì)胞的GI期或迫使細(xì)胞處于GO期而較長時間 的維持細(xì)胞高密度培養(yǎng)，從而盡可能的生產(chǎn)目的產(chǎn)物，由此也可以說明無血清培養(yǎng)能得到 更多的間充質(zhì)干細(xì)胞，并更好地保持其干細(xì)胞特性。
[0053] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的補充因子， 其特征在于，所述補充因子包括亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白、胰島素、纖粘連蛋白和 氫化可的松。2. 如權(quán)利要求1所述的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述補充因子還包括檸檬 酸鐵、二甲腫酸鐵、葡糖酸鐵中的一種或多種。3. 如權(quán)利要求1或2所述的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為 HffiM培養(yǎng)基。4. 如權(quán)利要求1或2所述的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述亞硒酸鈉在基礎(chǔ)培 養(yǎng)基中的濃度為8~10mg/ml。5. 如權(quán)利要求1或2所述的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述胰島素在基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中的濃度為9~llμg/ml ; 和/或，所述氫化可的松在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10 5~10 6mol/L。6. 如權(quán)利要求1或2所述的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白在基礎(chǔ)培 養(yǎng)基中的濃度為80~100 y g/ml。7. 如權(quán)利要求1或2所述的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述牛血清白蛋白在基 礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為0. 8~I. 2mg/ml ; 和/或，所述纖粘連蛋白在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為30~40ng/ml。8. 如權(quán)利要求1或2所述的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中還添加有 青霉素和鏈霉素，且所述青霉素的濃度為80~100U/ml、鏈霉素的濃度為80~100mg/ml。9. 如權(quán)利要求1至8任一項所述的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基在干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的補充因子，補充因子包括亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白、胰島素、纖粘連蛋白和氫化可的松。采用本發(fā)明的上述無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，其相對現(xiàn)有技術(shù)的血清培養(yǎng)基，可以避免血清批次間的質(zhì)量差異，提高細(xì)胞培養(yǎng)和試驗結(jié)果的重復(fù)性；并避免血清所帶來的外源性污染及血清組分的細(xì)胞毒性作用。并且其自身成分相對明確、質(zhì)量一致且蛋白含量低，有利于提高細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性并易于純化。同時，在上述幾種特定搭配維持干細(xì)胞增殖和性狀程度后，可通過延長細(xì)胞的GI期或迫使細(xì)胞處于G0期而較長時間的維持細(xì)胞高密度培養(yǎng)，能更好地保持其干細(xì)胞特性。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號】CN105087480
【申請?zhí)枴緾N201510519678
【發(fā)明人】曾憲卓, 魯菲
【申請人】深圳愛生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月21日