一種無創(chuàng)檢測(cè)胎兒耳聾致病基因突變的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因診斷領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種無創(chuàng)檢測(cè)胎兒耳聾致病基 因突變的方法。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)胎兒耳聾致病基因突變的試劑盒和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是造成人類殘疾和影響人類健康的常見疾病，也是臨床上最常見的遺傳 性疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每1000名新生兒中，有1例聽力障礙兒童（steelKP.New interventionsinhearingimpairment[J].BMJ，2000, 320 (4) :622 ~625)。造成耳聾有多 方面的原因，遺傳因素是最主要的。在出生時(shí)或3歲前就出現(xiàn)聽力喪失稱為學(xué)語前聽力缺 損，其中至少一半是遺傳缺陷所導(dǎo)致的。在大量遲發(fā)性聽力下降患者中，許多患者因自身基 因缺陷而致病，或因基因缺陷和多態(tài)性造成對(duì)環(huán)境因素的易感性增加而致病。據(jù)估計(jì)，全世 界非綜合征型遺傳性耳聾基因總數(shù)在100多個(gè)，結(jié)合國內(nèi)的研究進(jìn)展，我國被發(fā)現(xiàn)的耳聾 致病位點(diǎn)大部分集中在GJB2,GJB3,SLC26A4和線粒體12SrRNA上。
[0003] 為方便理解，下面對(duì)GJB2、GJB3和SLC26A4進(jìn)行簡要介紹。GJB2基因：該基因定 位于常染色體13qll-12區(qū)域，DNA全長4804bp，含2個(gè)外顯子，編碼區(qū)為678bp，編碼由266 個(gè)氨基酸殘基組成的縫隙連接蛋白Connexin26,屬于(6-2蛋白，是鉀離子循環(huán)通路的一部 分。GJB2基因突變?yōu)檫z傳性耳聾最常見的病因，GJB2基因突變導(dǎo)致的耳聾為語前、雙側(cè)、 對(duì)稱性耳聾，聽力損失程度變異較大，可由輕度到極重度，但多數(shù)為重度或極重度耳聾。在 中國人群中，常見GJB2基因突變類型主要有235delC、299-300delAT、176-191dell6等，可 占GJB2基因突變?nèi)巳旱?0%以上。GJB3基因：該基因定位在常染色體lq33-35區(qū)域，有2 個(gè)外顯子，編碼含有270個(gè)氨基酸的縫隙連接蛋白C〇nnexin31。GJB3基因突變可引起常染 色體顯性或隱性遺傳性非綜合征性耳聾，被認(rèn)為與高頻聽力下降有關(guān)。SLC26A4基因定位 于常染色體7q31區(qū)域，含21個(gè)外顯子，編碼1個(gè)由780個(gè)氨基酸殘基組成的多次跨膜蛋白 Pendrin，屬于離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族，主要與碘/氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，在機(jī)體離子成分平衡的維持 中發(fā)揮重要作用。近年來國外的多項(xiàng)研究表明SLC26A4基因突變與Pendred綜合征（PDS) (前庭水管擴(kuò)大或伴內(nèi)耳畸形神經(jīng)性聾和甲狀腺腫）和大前庭水管綜合征（LVAS)有密切的 關(guān)系。在眾多的突變中，多數(shù)突變既見于pendred綜合征，又見于大前庭水管綜合征。因此， 同一位點(diǎn)的突變可能導(dǎo)致不同的臨床表現(xiàn)。SLC26A4基因突變種類較多，但281C>T、589G >A.IVS7-2A>GU174A>T(N392Y)U226G>AU229C>T(T410M)U975G>C.2027T> A(L676Q)、2168A>G(HIS723ARG)和IVS15+5G>A突變體頻率高達(dá) 82. 51%。
[0004] 隨著科技的進(jìn)步，通過Sanger測(cè)序、基因芯片和蛋白檢測(cè)方法，許多新生嬰兒的 耳聾患者被診斷出來，在產(chǎn)前也有基于有創(chuàng)診斷胎兒耳聾致病基因的檢測(cè)，但是無創(chuàng)胎兒 耳聾致病基因的檢測(cè)還沒有人能夠?qū)崿F(xiàn)。
[0005] 發(fā)明簡述
[0006] 發(fā)明人探索了一種基于第二代高通量測(cè)序技術(shù)，利用孕婦的靜脈血的片段DNA檢 測(cè)胎兒耳聾致病基因的基因突變（基因型）的方法。自從母體血液中的胚胎DNA被發(fā)現(xiàn) 之后，無創(chuàng)傷地直接診斷和檢測(cè)胚胎染色體異常性和基因突變成為可能（LoYM等，（1997)PresenceoffetalDNAinmaternalplasmaandserum.Lancet, 350 :485-487) 〇第二代高通 量測(cè)序技術(shù)中，以Illumina產(chǎn)品為最優(yōu)，其中兩個(gè)代表性的產(chǎn)品MiSeq和HiSeq，一個(gè)以測(cè) 序長度見長，另一個(gè)以測(cè)序通量見長，本發(fā)明利用MiSeq測(cè)序儀。但是，血液中胚胎DNA的 含量低，如何快速和準(zhǔn)確的確定胎兒的相關(guān)基因型，仍然是需要解決的技術(shù)問題。
[0007] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是如何利用孕婦的靜脈血無創(chuàng)檢測(cè)胎兒的耳聾致病 基因的基因型。為此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提出一種能夠通過血漿DNA樣品有效檢測(cè) 胎兒中耳聾致病基因預(yù)定突變位點(diǎn)的基因突變的方法，包括以下步驟：
[0008]a)針對(duì)耳聾致病基因預(yù)定突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物；
[0009]b)提取孕婦的血漿DNA;
[0010] c)將所述提取的血漿DNA與預(yù)擴(kuò)增接頭連接，獲得連接產(chǎn)物；
[0011]d)對(duì)所述連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，獲得預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0012] e)對(duì)所述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行環(huán)化，獲得環(huán)化DNA分子；
[0013]f)利用所述引物對(duì)所述環(huán)化DNA分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；和 [0014]g)對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序并分析胎兒耳聾致病基因的突變。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述預(yù)定位點(diǎn)的突變選自GJB2基因、GJB3基 因和SLC26A4基因的22個(gè)位點(diǎn)的至少一種基因的突變。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述引物是一對(duì)背靠背的引物對(duì)。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述背靠背的引物對(duì)針對(duì)GJB2外顯子2、 GJB3外顯子2、SLC26A4外顯子3、SLC26A4外顯子5、SLC26A4外顯子7、SLC26A4內(nèi)含子7、 SLC26A4外顯子8、SLC26A4外顯子10、SLC26A4外顯子17或SLC26A4外顯子19而設(shè)計(jì)。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述背靠背引物對(duì)由一組疾病檢測(cè)點(diǎn)（即高 頻突變點(diǎn)）附近的背靠背引物組成。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述背靠背引物對(duì)帶有適用于不同高通量測(cè) 序平臺(tái)的通用引物區(qū)。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述背靠背引物對(duì)的序列分別為：
[0034]PDSlO-R(SEQIDNO：20) ：CAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATG
[0035]PDS17-F(SEQIDNO:22):TTCCTGGACGTTGTTGGAG
[0036]PDS17-R(SEQIDNO:23):GATATAGCTCCACAGTCAAGCAC
[0037]PDS19-F(SEQIDNO:25):TCTTGAGATTTCACTTGGTT
[0038]PDS19-R(SEQIDNO:26) :GTTCCATTTTAGAAACGGTA。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述背靠背引物對(duì)中的一對(duì)引物檢測(cè)一個(gè)或 多個(gè)位點(diǎn)。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述GJB2基因、GJB3基因和SLC26A4基因的 22個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)利用9對(duì)引物的一次PCR完成。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，所述接頭為barcode(多序列標(biāo)記）接 頭。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述接頭之間至少有兩個(gè)堿基差異。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述接頭是部分配對(duì)的Y型接頭。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟e)的環(huán)化所使用的方法為夾板式 環(huán)化，以與預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA兩端互補(bǔ)的單鏈DNA為夾板，由耐熱Taq連接酶完成環(huán)閉合。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟e)的環(huán)化為單體系循環(huán)多次反應(yīng)， 所述循環(huán)由DNA變性、夾板DNA退火和連接組成。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明所述方法進(jìn)一步包括消化未環(huán)化的線 性DNA分子。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明方法在于利用孕婦的靜脈血的片段 DNA檢測(cè)胎兒耳聾致病基因的基因型。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述耳聾致病基因具有插入、缺失、替換或基 因融合突變。
[0049] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種無創(chuàng)檢測(cè)胎兒耳聾致病基因突變的試劑盒，包 含：
[0050] 提取血漿DNA的試劑、DNA環(huán)化酶、目標(biāo)DNA擴(kuò)增引物和擴(kuò)增試劑。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述試劑盒進(jìn)一步包括耳聾致病基因預(yù)定位 點(diǎn)預(yù)擴(kuò)增引物及預(yù)擴(kuò)增試劑。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述試劑盒進(jìn)一步包括用于高通量測(cè)序的試 劑。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述血漿DNA與接頭連接，所述接頭為 barcode(多序列標(biāo)記）接頭。
[0054] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供針對(duì)耳聾致病基因預(yù)定位點(diǎn)的突變?cè)O(shè)計(jì)的引物在 制備用于無創(chuàng)檢測(cè)胎兒耳聾致病基因突變的診斷試劑或試劑盒中的用途，其特征在于，所 述診斷試劑或試劑盒適用于包括以下步驟的無創(chuàng)檢測(cè)胎兒耳聾致病基因突變的方法：
[0055]a)針對(duì)耳聾致病基因預(yù)定位點(diǎn)的突變?cè)O(shè)計(jì)引物；
[0056]b)提取孕婦的血漿DNA;
[0057]c)將所述提取的血漿DNA與預(yù)擴(kuò)增接頭連接，獲得連接產(chǎn)物；
[0058] d)對(duì)所述連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，獲得預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0059]e)對(duì)所述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行環(huán)化，獲得環(huán)化DNA分子；