盒，其特征在于，進(jìn)一步包括耳聾致病基因預(yù)定位點(diǎn) 預(yù)擴(kuò)增引物及預(yù)擴(kuò)增試劑。19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括用于高通量測(cè)序的試劑。20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，所述預(yù)定位點(diǎn)的突變選自GJB2基因、 GJB3基因和SLC26A4基因的22個(gè)位點(diǎn)的至少一種基因的突變。21. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，所述耳聾致病基因預(yù)定位點(diǎn)預(yù)擴(kuò)增 引物是一對(duì)背靠背的引物對(duì)。22. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，所述背靠背的引物對(duì)針對(duì)GJB2外顯 子2、GJB3外顯子3、SLC26A4外顯子3、SLC26A4外顯子5、SLC26A4外顯子7、SLC26A4內(nèi)含 子7、SLC26A4外顯子8、SLC26A4外顯子10、SLC26A4外顯子17或SLC26A4外顯子19而設(shè) 計(jì)。23. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，所述背靠背引物對(duì)由一組疾病檢測(cè) 點(diǎn)（即高頻突變點(diǎn)）附近的背靠背引物組成。24. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，所述背靠背引物對(duì)帶有適用于不同 高通量測(cè)序平臺(tái)的通用引物區(qū)。25. 根據(jù)權(quán)利要求21-24任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述背靠背引物對(duì)的序列 分別為： GJB2-F1(SEQ ID NO：2) ：CACGCTGCAGACGATCC GJB2-R1(SEQ ID NO：3) ：CCCCAATCCATCTTCTACTCT GJB2-F2(SEQ ID NO：4) ：TCCCACATCCGGCTATG GJB2-R2(SEQ ID NO：5) ：GATGGGGAAGTAGTGATCGTAG GJB3-F(SEQ ID NO：7) ：CGTGGACTGCTACATTGCC GJB3-R(SEQ ID NO：8) ：ATGTTGGGGCAGGGG PDS2-F(SEQ ID NO：10) ：CGTCATTTCGGGAGT PDS2-R(SEQ ID NO：11) ：CTAAGCAGCCATTCC PDS5-F(SEQ ID NO：13) ：CCCTGACTCTGCTGG PDS5-R(SEQ ID NO：14) ：CACTGGCAATCAGGA PDS7-F2(SEQ ID NO：16) ：TGGCAGTAGCAATTATCGTC PDS7-R2(SEQ ID NO：17) ：TTTCATATGGAGCCAACCTG PDSlO-F(SEQ ID NO：19) ：CCACTGCTCTTTCCCGC PDSlO-R(SEQ ID NO：20) ：CAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATG PDS17-F(SEQ ID NO：22) ：TTCCTGGACGTTGTTGGAG PDS17-R(SEQ ID NO：23) ：GATATAGCTCCACAGTCAAGCAC PDS19-F(SEQ ID NO：25) ：TCTTGAGATTTCACTTGGTT PDS19-R(SEQ ID NO :26) :GTTCCATTTTAGAAACGGTA。26. 根據(jù)權(quán)利要求21-24任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述背靠背引物對(duì)中的一 對(duì)引物檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。27.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其特征在于，所述GJB2基因、GJB3基因和SLC26A4 基因的22個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)利用9對(duì)引物的一次PCR完成。28. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，所述血漿DNA與接頭連接。29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的試劑盒，其特征在于，所述接頭為barcode (多序列標(biāo)記） 接頭。30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的試劑盒，其特征在于，所述接頭之間至少有兩個(gè)堿基差異。31. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的試劑盒，其特征在于，所述接頭是部分配對(duì)的Y型接頭。32. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，所述耳聾致病基因具有插入、缺失、 替換或基因融合突變。33. 針對(duì)耳聾致病基因預(yù)定位點(diǎn)的突變?cè)O(shè)計(jì)的引物在制備用于無(wú)創(chuàng)檢測(cè)胎兒耳聾致病 基因突變的診斷試劑或試劑盒中的用途，其特征在于，所述診斷試劑或試劑盒適用于包括 以下步驟的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)胎兒耳聾致病基因突變的方法： a) 針對(duì)耳聾致病基因預(yù)定位點(diǎn)的突變?cè)O(shè)計(jì)引物； b) 提取孕婦的血漿DNA ; c) 將所述提取的血漿DNA與預(yù)擴(kuò)增接頭連接，獲得連接產(chǎn)物； d) 對(duì)所述連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，獲得預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物； e) 對(duì)所述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行環(huán)化，獲得環(huán)化DNA分子； f) 利用所述引物對(duì)所述環(huán)化DNA分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；和 g) 對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序并分析耳聾致病基因的突變。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其特征在于，所述預(yù)定位點(diǎn)的突變選自GJB2基因、 GJB3基因和SLC26A4基因的22個(gè)位點(diǎn)的至少一種基因的突變。35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其特征在于，所述引物是一對(duì)背靠背的引物對(duì)。36. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其特征在于，所述背靠背的引物對(duì)針對(duì)GJB2外顯子 2、GJB3外顯子3、SLC26A4外顯子3、SLC26A4外顯子5、SLC26A4外顯子7、SLC26A4內(nèi)含子 7、SLC26A4外顯子8、SLC26A4外顯子KKSLC26A4外顯子17或SLC26A4外顯子19而設(shè)計(jì)。37.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其特征在于，所述背靠背引物對(duì)由一組疾病檢測(cè)點(diǎn) (即高頻突變點(diǎn)）附近的背靠背引物組成。38.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其特征在于，所述背靠背引物對(duì)帶有適用于不同高 通量測(cè)序平臺(tái)的通用引物區(qū)。39.根據(jù)權(quán)利要求35-38任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述背靠背引物對(duì)的序列分 別為： GJB2-F1(SEQ ID NO：2) ：CACGCTGCAGACGATCC GJB2-R1(SEQ ID NO：3) ：CCCCAATCCATCTTCTACTCT GJB2-F2(SEQ ID NO：4) ：TCCCACATCCGGCTATG GJB2-R2(SEQ ID NO：5) ：GATGGGGAAGTAGTGATCGTAG GJB3-F(SEQ ID NO：7) ：CGTGGACTGCTACATTGCC GJB3-R(SEQ ID NO：8) ：ATGTTGGGGCAGGGG PDS2-F(SEQ ID NO：10) ：CGTCATTTCGGGAGT PDS2-R(SEQ ID NO：11) ：CTAAGCAGCCATTCC PDS5-F(SEQ ID NO：13) ：CCCTGACTCTGCTGG PDS5-R(SEQ ID NO：14) ：CACTGGCAATCAGGA PDS7-F2(SEQ ID NO：16) ：TGGCAGTAGCAATTATCGTC PDS7-R2(SEQ ID NO：17) ：TTTCATATGGAGCCAACCTG PDSlO-F(SEQ ID NO：19) ：CCACTGCTCTTTCCCGC PDSlO-R(SEQ ID NO：20) ：CAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATG PDS17-F(SEQ ID NO：22) ：TTCCTGGACGTTGTTGGAG PDS17-R(SEQ ID NO：23) ：GATATAGCTCCACAGTCAAGCAC PDS19-F(SEQ ID NO：25) ：TCTTGAGATTTCACTTGGTT PDS19-R(SEQ ID NO :26) :GTTCCATTTTAGAAACGGTA。40.根據(jù)權(quán)利要求35-38任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述背靠背引物對(duì)中的一對(duì) 引物檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。41.根據(jù)權(quán)利要求34所述的用途，其特征在于，所述GJB2基因、GJB3基因和SLC26A4 基因的22個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)利用9對(duì)引物的一次PCR完成。42.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其特征在于，所述接頭為barcode(多序列標(biāo)記）接 頭。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的用途，其特征在于，所述接頭之間至少有兩個(gè)堿基差異。44.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其特征在于，所述接頭是部分配對(duì)的Y型接頭。45.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其特征在于，所述步驟e)的環(huán)化所使用的方法為夾 板式環(huán)化，以與預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA兩端互補(bǔ)的單鏈DNA為夾板，由耐熱Taq連接酶完成環(huán)閉 合。46.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其特征在于，所述步驟e)的環(huán)化為單體系循環(huán)多次 反應(yīng)，所述循環(huán)由DNA變性、夾板DNA退火和連接組成。47.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其特征在于所述方法進(jìn)一步包括消化未環(huán)化的線(xiàn)性 DNA分子。48.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其特征在于，所述耳聾致病基因具有插入、缺失、替 換或基因融合突變。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種無(wú)創(chuàng)檢測(cè)胎兒耳聾致病基因突變的方法、引物和試劑盒。本發(fā)明的方法包括：a)針對(duì)耳聾致病基因預(yù)定突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物；b)提取孕婦的血漿DNA；c)將所述提取的血漿DNA與預(yù)擴(kuò)增接頭連接，獲得連接產(chǎn)物；d)對(duì)所述連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，獲得預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物；e)對(duì)所述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行環(huán)化，獲得環(huán)化DNA分子；f)利用所述引物對(duì)所述環(huán)化DNA分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；和g)對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序并分析耳聾致病基因的突變。本發(fā)明可以有效地確定耳聾致病基因的預(yù)定位點(diǎn)是否發(fā)生了突變，以及所發(fā)生突變的類(lèi)型。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN105087756
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410174277
【發(fā)明人】劉異倩, 郭現(xiàn)超, 傅詠, 胡玉剛, 李天成, 張建光
【申請(qǐng)人】北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2014年4月23日
【公告號(hào)】EP2937422A1, US20150307942