比具有以下有益效果： 1.利用本發(fā)明的檢測引物、探針和試劑盒可以快速、簡便地對HPV病毒相關(guān)性疾病進(jìn) 行篩查，能同時檢測出常見的HPV高危型和低危型，共2種HPV低危型和14種HPV高危型， 且HPV高危型覆蓋范圍廣，比目前市場上的試劑盒檢測更為全面。
[0031] 2.本發(fā)明的檢測方法敏感性高，最低檢出可達(dá)到IXlO3拷貝/mL;同時，本發(fā)明 的檢測方法的特異性很好，不和其他的病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，例如HPV42型、HPV43型、HPV53 型、HPV73型和HPV83型； 3.本發(fā)明的檢測方法反應(yīng)快速，一般1. 5到2小時即可得到反應(yīng)結(jié)果，并且成本低、無 假陽性，適合于大規(guī)模臨床開展。從而實現(xiàn)對HPV病毒的快速、有效且準(zhǔn)確的定性檢測，因 而能保證及時的病例診治及治療效果監(jiān)測。
【附圖說明】
[0032] 圖1為采用熒光定量PCR儀檢測HPV假病毒質(zhì)控品得到的曲線； 圖 2 是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35 和HPV39 的熒光定量PCR檢測 曲線； 圖 3 是HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和HPV68 的熒光定量PCR檢 測曲線； 圖4是HPV42、HPV43、HPV53、HPV73和HPV83的熒光定量PCR檢測曲線。
【具體實施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。
[0034] 實施例IHPV質(zhì)控品的構(gòu)建 (1)將16種型別的HPV病毒片段連接后制備成為假病毒。
[0035] 將16種型別的HPV病毒分別以各自相應(yīng)的特異性引物擴(kuò)增出片段(例如HPV6型 病毒模板，使用本發(fā)明設(shè)計的HPV6型上游引物HPV6-F和下游引物HPV6-R進(jìn)行擴(kuò)增，收集 產(chǎn)物)，16種型別的HPV病毒擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)基因測序確認(rèn)正確后包裝成假病毒，假病毒由北京 博恒科創(chuàng)生物科技有限公司進(jìn)行制備并提供濃度。
[0036] (3)將HPV假病毒按照北京博恒科創(chuàng)生物科技有限公司提供的濃度進(jìn)行稀釋，分 別稀釋至IXIO5拷貝/mL和5X10 3拷貝/mL，然后采用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行檢 測。
[0037] 結(jié)果如圖1所示：左邊是16種HPV型別引物探針檢測到的IXIO5拷貝/mL的假 病毒，右邊是16種HPV型別引物探針檢測到的5XIO3拷貝/mL的假病毒的擴(kuò)增曲線。
[0038] 將HPV假病毒稀釋成IXlO5拷貝/mL、5X103拷貝/mL，分別作為試劑盒的陽性質(zhì) 控品和弱陽性質(zhì)控品。
[0039] 實施例2檢測試劑盒組成及使用 1、試劑盒組成
其中，HPV6 型、HPV16 型、HPV31 型、HPV35 型、HPV39 型、HPV45 型、HPV58 型和HPV68 型 的Taqman熒光探針核苷酸序列5'端標(biāo)記6-FAM，3'端標(biāo)記BHQl; HPVll型、HPV18 型、HPV33 型、HPV51 型、HPV52 型、HPV56 型、HPV59 型和HPV66 型的Taqman熒光探針核苷酸序列5'端標(biāo)記HEX;所述熒3'端標(biāo)記BHQl。
[0040] 各組引物探針混合液由初始濃度10yM的每種引物序列0. 75yL，初始濃度10yM 的探針〇. 5yL，最后用無菌超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)足至5. 5yL。
[0041] 2、試劑盒使用方法如下： (1)宮頸分泌物樣本：取ImL樣本至I. 5mL離心管中，12000rpm離心2分鐘，棄上清； 沉淀中加入500yL滅菌生理鹽水混勻，12000rpm離心2分鐘；再用滅菌生理鹽水重復(fù)洗滌 一次；去盡上清，沉淀中加入50yLHPV裂解液充分混勻，95°C作用10分鐘，12000rpm離心 10分鐘，上清即為純化的病毒核酸，作為待檢模板。（待檢模板的提取可以使用現(xiàn)有技術(shù)中 任意方法，只要能獲得樣本DNA核酸即可，也可以直接使用市售商品DNA提取試劑盒，不限 于上述方法)。
[0042] (2)取PCR反應(yīng)液14. 5yL分別置于8個反應(yīng)管內(nèi)，分別加入8組引物探針混合液 5. 5yL(1個單位）配制成反應(yīng)體系，然后分別加入5. 0yL待檢模板。
[0043] 熒光定量PCR反應(yīng)條件：37°C，2分鐘；95°C，3分鐘；94°C，15秒；60°C，45秒，40個 循環(huán)。
[0044] 采用ABI7500熒光定量PCR儀，熒光信號收集時設(shè)定為FAM和VIC(HEX)熒光素， 熒光信號收集設(shè)在60 °C。
[0045] 每批次反應(yīng)均設(shè)置陰性質(zhì)控品（滅菌生理鹽水)、陽性質(zhì)控品和弱陽性質(zhì)控品（HPV 假病毒)。
[0046] (3)結(jié)果判斷：檢測通道沒有出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，判定為HPV病毒陰性。
[0048] 3、臨床檢測 利用上述方法對1例HPV6型宮頸分泌物樣本、1例HPVll型宮頸分泌物樣本、1例HPV16 型宮頸分泌物樣本、1例HPV18型宮頸分泌物樣本、1例HPV31型宮頸分泌物樣本、1例HPV33 型宮頸分泌物樣本、1例HPV35型宮頸分泌物樣本、1例HPV39型宮頸分泌物樣本、1例HPV45 型宮頸分泌物樣本、1例HPV51型宮頸分泌物樣本、1例HPV52型宮頸分泌物樣本、1例HPV56 型宮頸分泌物樣本、1例HPV58型宮頸分泌物樣本、1例HPV59型宮頸分泌物樣本、1例HPV66 型宮頸分泌物樣本、1例HPV68型宮頸分泌物樣本、1例HPV42型國家參考品、1例HPV43型 國家參考品、1例HPV53型國家參考品、1例HPV73型國家參考品和1例HPV83型國家參考 品，共計21份樣本進(jìn)行檢測。國家參考品是由中國食品藥品檢定研究院制備的國家標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì)，包含HPV各種型別的質(zhì)粒，是由北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司研發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0049]結(jié)果如圖 2~ 圖 4 所示，圖 2 是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35 和 HPV39 的檢測曲線；圖 3 是HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和HPV68 的檢 測曲線；圖4是HPV42、HPV43、HPV53、HPV73和HPV83的檢測曲線： 其中 16 例宮頸分泌物樣本（HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和HPV68)檢測均為陽性，有S型擴(kuò)增曲 線（圖2和圖3) ;5例國家參考品（HPV42、HPV43、HPV53、HPV73和HPV83)檢測均為陰性，無 S型擴(kuò)增曲線（圖4)。
[0050] 結(jié)果驗證：將檢測陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對后證實 為16種型別的HPV病毒基因序列。
[0051] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
I. 16種型別HPV病毒的檢測引物和探針，其特征在于，包括16種型別基因的特異性擴(kuò) 增引物序列以及與該引物相應(yīng)的Taqman熒光探針序列，探針序列的5'端標(biāo)記有熒光報告 基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，各型別檢測引物及探針序列如下： HPV6 型： 上游引物HPV6-F :核苷酸序列如SEQ ID NO: 1， 下游引物HPV6-R:核苷酸序列如SEQ ID NO:2， Taqman熒光探針HPV6-P :核苷酸序列如SEQ ID NO: 3 ; HPVll 型： 上游引物HPVll-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:4， 下游引物HPVll-R :核苷酸序列如SEQ ID N0:5， Taqman熒光探針HPVll-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:6 ; HPV16 型： 上游引物HPV16-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:7， 下游引物HPV16-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:8， Taqman熒光探針HPV16-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:9 ; HPV18 型： 上游引物HPV18-F :核苷酸序列如SEQ ID NO: 10， 下游引物HPV18-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:11， Taqman熒光探針HPV18-P :核苷酸序列如SEQ ID NO: 12 ; HPV31 型：