上游引物HPV31-F :核苷酸序列如SEQ ID NO: 13， 下游引物HPV31-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:14， Taqman熒光探針HPV31-P :核苷酸序列如SEQ ID NO: 15 ; HPV33 型： 上游引物HPV33-F :核苷酸序列如SEQ ID NO: 16， 下游引物HPV33-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:17， Taqman熒光探針HPV33-P :核苷酸序列如SEQ ID NO: 18 ; HPV35 型： 上游引物HPV35-F :核苷酸序列如SEQ ID NO: 19， 下游引物HPV35-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:20， Taqman熒光探針HPV35-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:21 ; HPV39 型： 上游引物HPV39-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:22， 下游引物HPV39-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:23， Taqman熒光探針HPV39-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:24 ; HPV45 型： 上游引物HPV45-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:25， 下游引物HPV45-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:26， Taqman熒光探針HPV45-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:27 ; HPV51 型： 上游引物HPV51-F :核苷酸序列如SEQ ID NO:28， 下游引物HPV51-R :核苷酸序列如SEQ ID NO:29， Taqman熒光探針HPV51-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:30 ; HPV52 型： 上游引物HPV52-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:31， 下游引物HPV52-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:32， Taqman熒光探針HPV52-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:33 ; HPV56 型： 上游引物HPV56-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:34， 下游引物HPV56-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:35， Taqman熒光探針HPV56-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:36 ; HPV58 型： 上游引物HPV58-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:37， 下游引物HPV58-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:38， Taqman熒光探針HPV58-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:39 ; HPV59 型： 上游引物HPV59-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:40， 下游引物HPV59-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:41， Taqman熒光探針HPV59-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:42 ; HPV66 型： 上游引物HPV66-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:43， 下游引物HPV66-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:44， Taqman熒光探針HPV66-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:45 ; HPV68 型： 上游引物HPV68-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:46， 下游引物HPV68-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:47， Taqman熒光探針HPV68-P:核苷酸序列如SEQ ID N0:48。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的16種型別HPV病毒的檢測引物和探針，其特征在于，所述熒 光報告基團選自6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、 羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲 氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁3. 5、花菁5和花菁5. 5中的至少一種；所述熒光淬 滅基團選自6-羧基四甲基羅丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基）苯甲酸、黑洞淬滅劑1、黑 洞淬滅劑2或黑洞淬滅劑3中的至少一種。
3. -種檢測16種型別HPV病毒的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1或2所述的16 種型別HPV病毒的檢測引物和探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測16種型別HPV病毒的試劑盒，其特征在于，還包括PCR 反應(yīng)液，陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，其中陰性質(zhì)控品為滅菌生理鹽水，陽性質(zhì)控品和弱陽性 質(zhì)控品是以提純的16種型別HPV病毒基因組為模板，由權(quán)利要求1中16種型別相應(yīng)的基 因擴增引物進行PCR擴增，16種擴增產(chǎn)物連接，經(jīng)基因測序確認正確后包裝所得的假病毒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測16種型別HPV病毒的試劑盒，其特征在于，盒內(nèi)試劑包 括獨立包裝的HPV裂解液、PCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品和以下8組 引物探針混合液： A組：由HPV 6型和HPV 11型的上游引物、下游引物和Taqman熒光探針溶于無菌超純 水組成； B組：由HPV 16型和HPV 18型的上游引物、下游引物和Taqman熒光探針溶于無菌超 純水組成； C組：由HPV 31型和HPV 52型的上游引物、下游引物和Taqman熒光探針溶于無菌超 純水組成； D組：由HPV 33型和HPV45型的上游引物、下游引物和Taqman熒光探針溶于無菌超純 水組成； E組：由HPV 35型和HPV 51型的上游引物、下游引物和Taqman熒光探針溶于無菌超 純水組成； F組：由HPV 39型和HPV 59型的上游引物、下游引物和Taqman熒光探針溶于無菌超 純水組成； G組：由HPV 56型和HPV 68型的上游引物、下游引物和Taqman熒光探針溶于無菌超 純水組成； H組：由HPV56型和HPV 68型的上游引物、下游引物和Taqman熒光探針溶于無菌超純 水組成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測16種型別HPV病毒的試劑盒，其特征在于，HPV6型、 HPV16 型、HPV31 型、HPV35 型、HPV39 型、HPV45 型、HPV58 型和 HPV68 型的 Taqman 熒光探針 核苷酸序列5'端標記6-FAM，3'端標記BHQl ; HPVll 型、HPV18 型、HPV33 型、HPV51 型、HPV52 型、HPV56 型、HPV59 型和 HPV66 型的 Taqman焚光探針核苷酸序列5'端標記HEX ;3'端標記BHQl。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測16種型別HPV病毒的試劑盒，其特征在于，陽性質(zhì)控品 中假病毒的濃度為I X IO5拷貝/mL，弱陽性質(zhì)控品中假病毒的濃度為I X 10 3拷貝/mL。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測16種型別HPV病毒的試劑盒，其特征在于，各組引物探 針混合液中，上游引物、下游引物和探針的濃度均為10 y M，上游引物用量0. 75 y L，下游引 物用量0. 75 y L，探針用量0. 5 y L，最后用無菌超純水補足至5. 5 y L。
9. 權(quán)利要求8所述的檢測16種型別HPV病毒的試劑盒的使用方法，其特征在于，待 檢樣品使用HPV裂解液采用煮沸裂解法提取DNA，分別加入到8組引物探針混合液，再加入 PCR反應(yīng)液，混勻后進行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為35~38°C條件下反應(yīng)1~3分鐘；93~95°C 條件下反應(yīng)3~5分鐘；然后92~95°C反應(yīng)10~15秒，55~65°C反應(yīng)10~45秒，共35~45個循 環(huán)；熒光信號收集時設(shè)定為FAM和HEX熒光素，熒光信號收集設(shè)在60 °C ; 結(jié)果判斷： 如果檢測通道沒有出現(xiàn)S型擴增曲線，判為HPV病毒陰性；如果檢測通道出現(xiàn)S型擴增 曲線，Ct值< 36,則對應(yīng)的HPV型別判定為陽性；擴增曲線。
【專利摘要】本發(fā)明公開了16種型別HPV病毒的檢測引物、探針及試劑盒，該引物及探針可以快速、準確、簡便地對HPV病毒相關(guān)性疾病進行篩查，不與其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，能同時檢測出常見的HPV高危型和低危型，共2種HPV低危型和14種HPV高危型，且HPV高危型覆蓋范圍廣，比目前市場上的試劑盒檢測更為準確和全面。本發(fā)明的試劑盒還包括陰性、陽性和弱陽性質(zhì)控品，進一步增加了檢測的準確性。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/70, C12Q1/68, C12R1/93
【公開號】CN105087827
【申請?zhí)枴緾N201510518350
【發(fā)明人】朱柳, 王佳, 劉沛
【申請人】北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月21日