是，本發(fā)明的方法和裝置匹配該需求。此外， 當(dāng)使用標(biāo)記聚合酶時可測量聚合酶結(jié)合到模板DNA和引物DNA的速率/聚合酶從模板DNA 和引物DNA解離的速率。本發(fā)明方法和裝置的這些細(xì)節(jié)將在下文中進(jìn)行詳細(xì)解釋。
[0033] 此外，本發(fā)明的方法促進(jìn)由淬滅介質(zhì)像是例如基底上的淬滅層提供的淬滅機(jī)構(gòu)的 使用，其允許非放射性能量從標(biāo)記轉(zhuǎn)移到淬滅介質(zhì)。在本發(fā)明的該實施例和每個其他實施 例中可選取所使用的標(biāo)記和所使用的淬滅介質(zhì)的組合，使得當(dāng)標(biāo)記接近淬滅介質(zhì)時從激勵 的標(biāo)記轉(zhuǎn)移到淬滅介質(zhì)中的表面等離子體的非放射性能量淬滅標(biāo)記信號的發(fā)射，反之亦 然。從物理的角度，應(yīng)注意以下方面。所施加的到所述淬滅介質(zhì)偏壓極化淬滅介質(zhì)，例如圖 1的電極107,導(dǎo)致Gouy-Chapman-Stern屏蔽層的形成。當(dāng)標(biāo)記以遠(yuǎn)距離依賴方式接近表 面時，淬滅層中從標(biāo)記轉(zhuǎn)移到表面等離子體的非放射性能量可淬滅發(fā)射的信號強(qiáng)度。因此， 高信號強(qiáng)度表示從淬滅介質(zhì)到標(biāo)記的大距離，在這種情況下其起淬滅介質(zhì)的作用。低信號 強(qiáng)度表示從淬滅介質(zhì)到標(biāo)記的近距離。通過例如附圖1到12這會變得顯而易見并且會通 過例如圖1到12進(jìn)行說明。
[0034] 因此，可將本發(fā)明的方法視為用于通過改變淬滅介質(zhì)與標(biāo)記之間的距離來檢測， 例如光學(xué)地，單個核苷酸的結(jié)合的方法。在所述方法的過程或者可通過本發(fā)明的裝置記錄 光致發(fā)光信號改變，并且可促進(jìn)確定核苷酸結(jié)合事件。因此，本發(fā)明的方法可被視為基于非 標(biāo)記核苷酸的結(jié)合對模板核酸測序的方法。
[0035] 在示例性實施例中，本發(fā)明利用非常遠(yuǎn)程的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制來測量幾百納米上淬滅 介質(zhì)上標(biāo)記之間的距離。通常在現(xiàn)有技術(shù)中，研究人員采用"熒光共振能量轉(zhuǎn)移"（FRET，也 被稱為F_6rster共振能量轉(zhuǎn)移）來光學(xué)地測量分子距離。傳統(tǒng)FRET從供體發(fā)生到受體分 子并且具有僅IOnm的典型范圍。與之對比，我們設(shè)計了一種方案，受體可被實施為二維淬 滅層。該形式的特征在于概念上的不同、特別地遠(yuǎn)程的能量轉(zhuǎn)移距離依賴。這導(dǎo)致下面將 會解釋的改進(jìn)測序。
[0036] 在一種具體地開發(fā)的實施例中，本發(fā)明的方法可被視為基于距離依賴淬滅檢測核 苷酸結(jié)合的方法。關(guān)于淬滅的各種方面和適合的淬滅工具會在下文中公開和解釋。特別地， 所述方法可利用淬滅介質(zhì)和標(biāo)記的結(jié)合，使得淬滅介質(zhì)的吸引光譜在一定程度上符合標(biāo)記 的發(fā)射光譜?？蛇x取所述結(jié)合以促進(jìn)非放射性能量轉(zhuǎn)移。本發(fā)明方法使用的淬滅機(jī)制可被 視為連續(xù)過程或淬滅介質(zhì)與設(shè)置越過長距離的標(biāo)記之間的相互作用。這種長距離相互作用 可存在至少0到300納米之間?？墒褂迷诟L距離上也有效的淬滅機(jī)制?？蛇x取在0.2到 0. 4納米的范圍內(nèi)靈敏的淬滅機(jī)制。其促進(jìn)對單個核苷酸結(jié)合到模板核酸中的檢測。
[0037] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是淬滅介質(zhì)可具體化為淬滅層。淬滅層可具體化為薄 層，例如具有低厚度的導(dǎo)電電極。由于低厚度使得淬滅介質(zhì)在下文中被稱為二維淬滅層。所 述厚度可以在例如5-300nm之間。該層可設(shè)置在基底上并且可通過從標(biāo)記到淬滅層的非放 射性能量轉(zhuǎn)移促進(jìn)淬滅機(jī)制的使用。也可使用單原子層?？蛇x取所使用的標(biāo)記和所使用的 淬滅層的組合，使得當(dāng)標(biāo)記接近淬滅層時從激勵的標(biāo)記轉(zhuǎn)移到淬滅層中的表面等離子體的 非放射性能量淬滅標(biāo)記信號的發(fā)射，反之亦然。因此淬滅層能夠被所施加的偏壓極化，導(dǎo)致 Gouy-Chapman-Stern屏蔽層的形成。作為非限制性示例可對圖1的淬滅層電極107供應(yīng) DC或AC偏壓使得電極被極化并且標(biāo)記和表面等離子體可發(fā)生相互作用。在下文中將會詳 細(xì)給出這種淬滅層的示例性變型。
[0038] 在一種示例性實施例中，標(biāo)記是光致發(fā)光（PL)標(biāo)記，淬滅介質(zhì)是生物芯片的基底 上的金屬層。所用的淬滅效應(yīng)可選取為關(guān)于光致發(fā)光標(biāo)記到金屬層的在〇. 2到0. 4納米范 圍內(nèi)的距離敏感。但是其他敏感性也是可能的。一般地，DNA或RNA的堿基對間隔為0. 34 納米。本發(fā)明利用由于核苷酸在該范圍內(nèi)，即，0.34納米范圍內(nèi)的結(jié)合引起的標(biāo)記的移動。 通過對以下解釋的說明將會顯而易見，在一個核苷酸結(jié)合的情況下光致發(fā)光強(qiáng)度提高或跳 躍某一特性、預(yù)定值。根據(jù)所述特性、預(yù)定值，本發(fā)明的方法可光學(xué)地檢測提供到例如溶液 中基底的所述類型核苷酸是否與沿著緊挨單鏈/雙鏈結(jié)的模板DNA的即將到來的未配對核 苷酸互補(bǔ)。
[0039] 本發(fā)明方法的另一有價值方面是包括多個模板DNA分子的單分子測量以及全體 測量都得到了促進(jìn)。在所述單分子測量中，只使用一個模板核酸。這可從例如圖la、lb、5 和6得知。在所述整體測量中，具有退火的相應(yīng)核酸引物的多個模板核酸可設(shè)置在基底或 不同的基底上。如下文將更加詳細(xì)解釋的，通過本發(fā)明的方法和用于在兩種測量（單分子 測量和全體分子測量）中測序的裝置能夠檢測僅一個核苷酸的結(jié)合。在全體測序構(gòu)造中， 提供一種包括多個復(fù)合物的復(fù)合物層。下面將會在單分子構(gòu)造的相關(guān)描述中對本發(fā)明進(jìn)行 詳細(xì)解釋。但是，也可利用本發(fā)明同時對多個復(fù)合物進(jìn)行測序。就這一點而言，我們利用術(shù) 語"DNA層"指代這種構(gòu)造。
[0040] 另外，本發(fā)明的方法可被視為用于在測序中使用的方法?？裳a(bǔ)充一些重復(fù)或附加 步驟來完全地確定模板核酸的序列。這種重復(fù)和附加方法步驟將在下文中進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0041] 在用本發(fā)明的方法測序的過程中，無標(biāo)記核苷酸，例如dATP、dCTP、dGTP和/或 dTTP以及它們的衍生物可在基底的表面上順序地交換，同時可實時記錄標(biāo)記的信號強(qiáng)度。 由聚合酶引起的沿模板DNA的匹配核苷酸的結(jié)合被檢測為信號強(qiáng)度的增加，因為標(biāo)記運動 遠(yuǎn)離淬滅介質(zhì)。由于DNA的雙鏈部分變得細(xì)長，這導(dǎo)致標(biāo)記到基底和淬滅介質(zhì)的距離的增 加。如下文描述的，有利地，可從失配核苷酸區(qū)分匹配核苷酸。也可識別模板上修改的例如 甲基化或損壞核苷酸?？纱_定模板核酸上的核苷酸結(jié)合速率和聚合酶結(jié)合/解離速率。
[0042] 所述方法和測序裝置的使用者知道在測序過程中在給定時間點向基底添加何種 類型的核苷酸例如dATP、dGTP、dTTP或dCTP，如果檢測到結(jié)合事件，可確定模板核酸中的互 補(bǔ)核苷酸。但是，如下文中將詳細(xì)解釋的，也可在溶液中向基底提供多個核苷酸，其中，它們 可以是相同類型，也可以是不同類型。
[0043] 通常，所述信號可被視為信號強(qiáng)度或其衍生物。也就是說，本發(fā)明的方法可被視為 相對于標(biāo)記與淬滅介質(zhì)之間距離的信號強(qiáng)度形式的反饋。
[0044] 借助于特殊鏈結(jié)和/或共吸引分子和/或施加的DC模式電場，模板核酸可剛性地 對齊到表面上的理想定向，像是例如準(zhǔn)豎直定向。但是這種有利對齊僅是可選的，將在下文 中對其進(jìn)行更加詳細(xì)的描述。
[0045] 另外，至少在添加核苷酸之前和之后的觀察標(biāo)記信號的步驟可通過第一觀察添加 核苷酸之前的信號和第二觀察添加核苷酸之后的信號執(zhí)行。但是該方法步驟也包括連續(xù)觀 察，例如圖3所示。因此，也包括添加之前、之后和過程中的標(biāo)記的信號。作為示例性實施 例，示出標(biāo)記的信號的連續(xù)、時間分辨的觀察、檢測和/或記錄。
[0046] 在該示例性實施例和每個其他示例性實施例中，捕捉核酸可用來將模板和引物結(jié) 合到基底或電極。本文中捕捉核酸可以是具有第一鏈端和第二鏈端的雙鏈捕捉核酸。將會 在下文中對其進(jìn)行更加詳細(xì)的解釋。
[0047] 應(yīng)該注意的是本發(fā)明包括單鏈固定化，S卩，只在一個鏈處固定化DNA模板。所述模 板核酸、引物以及捕捉核酸可只在一個鏈處固定化到基底。如果可建立到基底的相對于DNA 的運動自由度足夠剛性的連接，則這對于執(zhí)行本發(fā)明是充分的。因此，也是在該情況下，使 用者可提供有非常靈敏的測序方法。可通過例如化學(xué)地修改模板益生元或捕捉寡核苷酸的 鏈的一端和/或通過結(jié)合適當(dāng)?shù)剡x取的化學(xué)鏈結(jié)建立到基底的結(jié)合來實現(xiàn)單鏈固定化。但 是在優(yōu)選實施例中，具有模板和引物的復(fù)合物的兩端經(jīng)由兩個鏈結(jié)合到基底，如圖Ia和Ib 所示。特別地，如果使用了捕捉核酸，所述捕捉寡核苷酸可通過其兩個鏈結(jié)合到基底。如果 只使用了引物和模板核酸而未使用捕捉核酸，則本發(fā)明包括，不管使用者的喜好是什么，得 到的雙鏈可經(jīng)由僅一個鏈端或經(jīng)由兩個鏈端結(jié)合到基底。
[0048] 本文提出的方法由技術(shù)人員在適合的溫度下執(zhí)行。一個適合的示例性溫度范圍可 介于4°C與80°C之間以實現(xiàn)理想測序。但是，也可使用其他范圍。特別地，可根據(jù)所使用的 聚合酶優(yōu)化和選取所使用/所應(yīng)用的溫度。由于可使用不同的聚合酶，應(yīng)用的溫度可以變 化。也可選取溫度使得所使用的引物仍然雜交到模板。
[0049] 根據(jù)另一示例性實施例，提供雙鏈捕捉核酸的所謂"50%總體"。這里，50%的捕捉 核酸在長鏈處或經(jīng)由長鏈結(jié)合到基底，剩余50%的捕捉核酸在短鏈處或經(jīng)由短鏈結(jié)合到基 底。
[0050] 這可提供的優(yōu)點是，旋轉(zhuǎn)效應(yīng)被抵消，可觀察到堿基對間隔的標(biāo)記的凈高度增加， 近似0.34nmX sina，與表面成角a。這避免的缺點是，如果DNA不是完全豎直對齊的，對 于某些添加的核苷酸來說Ah的凈增加可為零或變成負(fù)的，而對于其他的核苷酸來說其變 得大于0. 34nm。因此，該實施例可提供改進(jìn)的信號質(zhì)量。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的另一示例性實施例，所述方法還可包括重復(fù)步驟a)和b)以確定所 述模板核酸的完整序列的步驟。
[0052] 如之前說明的，對于核苷酸是否結(jié)合的確定，S卩，結(jié)合事件的檢測可具體化為例如 PL標(biāo)記的修改光致發(fā)光（PL)信號的光學(xué)檢測。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的另一示例性實施例，核苷酸是未標(biāo)記的。
[0054] 根據(jù)本發(fā)明的另一示例性實施例，提出了經(jīng)由捕捉核酸在基底上固定化模板核酸 的步驟。
[0055] 這里，捕捉核酸可被視為結(jié)合單元。捕捉核酸減少DNA的運動自由度，如下文所描 述的，這對于確定結(jié)合事件是有利的。通過經(jīng)由捕捉核酸將模板核酸固定化在基底上執(zhí)行 對齊，這會改進(jìn)對標(biāo)記所發(fā)出信號的檢測。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的另一示例性實施例，捕捉核酸是具有第一鏈端和第二鏈端的雙鏈捕 捉核酸。所述方法還包括借助于第一鏈端處的第一化學(xué)鏈結(jié)和第二鏈端處的第二化學(xué)鏈結(jié) 將雙鏈捕捉核酸固定化在基底上的步驟。
[0057] 如已經(jīng)關(guān)于之前實施例進(jìn)行解釋的，該固定化步驟也導(dǎo)致經(jīng)由捕捉核酸結(jié)合到基 底的模板核酸的對齊。這可參見例如圖Ia和圖lb。兩個之前描述的實施例都確保模板核 酸對齊是適當(dāng)?shù)暮蛣傂枣i定的，并且可選取所述定向使其相對于基底的表面幾乎豎直。如 果需要的話，本發(fā)明可應(yīng)用附加對齊手段。此外，可選取例如鏈結(jié)系統(tǒng)以進(jìn)一步減少DNA的 運動自由度。因此，可在DNA與表面之間建立結(jié)構(gòu)剛性連接。
[0058] 根據(jù)本發(fā)明的另一示例性實施例，所述方法還包括通過向捕捉核酸上施加力來相 對于基底的表面以理想角度構(gòu)造對齊捕捉核酸的步驟。
[0059] 特別地，可提供對齊工具使得捕捉核酸以豎直方向提供。這還可改進(jìn)所提出的測 序方法的信號質(zhì)量。這里，對齊可被視為在例如豎直方向上固定、保持、維持空間恒定。如 下文將會更加詳細(xì)解釋的，也可通過例如施加DC電壓和共吸引分子來使用組合力，所述組 合力的合力施加在捕捉核酸上。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明的另一示例性實施例，捕捉核酸的對齊是豎直的。
[0061] 本文中，術(shù)語"豎直"可被視為基本豎直或在近似豎直的方向上。在本發(fā)明的該實 施例中可允許從模板核酸的精確90°定向的偏差。特別地，術(shù)語"豎直方向"應(yīng)被解釋為相 對于基底。因此，通過所描述的對齊措施實現(xiàn)捕捉核酸相對于基底表面的垂直定向。
[0062] 根據(jù)另一示例性實施例，所述方法包括向淬滅層施加DC電壓或AC電壓的步驟。 因此可將淬滅層視為電極。如下文將會更加詳細(xì)描述的，所述電壓可施加在基底上淬滅層 /電極和反電極之間。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明的另一示例性實施例，施加到捕捉核酸上的力是通過在基底上電極和 反電極之間施加DC電壓提供的。
[0064] 可從例如圖Ia和Ib得知該實施例，下面將會進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0065] 根據(jù)本發(fā)明的另一示例性實施例，所述方法還包括在捕捉核酸旁邊將共吸引分子 施加在基底上用于空間地排斥模板核酸和/或捕捉核酸的步驟。
[0066] 通過例如圖Ia和Ib可得知共吸引分子的一種示例性應(yīng)用，其中會公開用于共吸 引分子的不同實施例。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明的另一示例性實施例，所述方法包括以下步驟：在模板核酸處高度hi 處提供標(biāo)記；將核苷酸結(jié)合到模板核酸中從而引起淬滅介質(zhì)上方標(biāo)記的從高度hi到高度 h2的高度改變。此外，包括根據(jù)從高度hi到高度h2的變化記錄標(biāo)記信號的變化的步驟。
[0068] 也就是說，核苷酸在退火至所述模板核酸的核酸引物的3'端處結(jié)合到模板中是基 于觀察到的信號，其表示高度從hi到h2的改變。例如，這可通過圖1中所示的計算單元 122完成。因此，本發(fā)明的方法和測序裝置允許根據(jù)特性信號改變檢測標(biāo)記的高度改變。為 了該目的，可將信號改變的特性值儲存在例如測序裝置中，例如儲存在計算單元中。如圖1 所示，高度的改變可增加。但是本發(fā)明尤其是該示例性實施例也可