06。
[0132] 圖2示出40堿基對DNA層的電壓響應(yīng)并描述本發(fā)明的示例性實施例使用的距離 依賴淬滅機(jī)制的原理。圖2示出如何通過向支撐電極合適地施加負(fù)電壓來使端部系縛40bp DNA鏈成直立定向。另外，圖2示意性地示出淬滅量與標(biāo)記到淬滅介質(zhì)的距離的依賴關(guān)系。 示例性地，這里淬滅介質(zhì)具體化為電極，鏈結(jié)結(jié)合到所述電極。當(dāng)施加-0. 2V電壓（ITOi 電極，50mM NaCl溶液）時結(jié)合到DNA上端的標(biāo)記接近最大值。通過考慮以下方面這可以得 到解釋，（i)帶負(fù)電荷的DNA被帶負(fù)電荷的電極表面排斥，（ii)從用星示出的標(biāo)記轉(zhuǎn)移的非 放射性能量隨著DNA的頂端運動遠(yuǎn)離PL淬滅層變?nèi)?。一并考慮，這表示直立DNA定向。在 橫臥構(gòu)造201中，發(fā)射203由于標(biāo)記接近能量吸收電極而被淬滅，信號強(qiáng)度較低。在立式構(gòu) 造/定向200中，因為標(biāo)記與淬滅介質(zhì)之間的距離較大，淬滅較低。因此，標(biāo)記的發(fā)射強(qiáng)度 202較高。附圖標(biāo)記204和205表示通過向電極施加負(fù)電場使DNA鏈被排斥和通過向電極 施加正電場時DNA被吸引。選取本文中使用的標(biāo)記和淬滅介質(zhì)的組合，使得當(dāng)標(biāo)記接近淬 滅介質(zhì)時從被激勵的標(biāo)記轉(zhuǎn)移到淬滅介質(zhì)中表面等離子體的非放射性能量淬滅標(biāo)記信號 的發(fā)射，即，以距離依賴方式。圖2中示出的圖表反映觀察/檢測到的標(biāo)記的熒光性對施加 電壓的依賴關(guān)系，所述施加電壓對應(yīng)于標(biāo)記到淬滅介質(zhì)的距離。
[0133] 圖3示出本發(fā)明的一種示例性實施例，其中光致發(fā)光（PL)標(biāo)記與模板核酸100共 價或非共價結(jié)合，如圖1的相關(guān)內(nèi)容示例性描述的。下面在圖3的相關(guān)內(nèi)容中提出測序方 案的一種示例性實施例。可通過圖3 (步驟1)得知，隨時間連續(xù)地測量PL標(biāo)記117的PL 強(qiáng)度102?？蛇x地，可向作業(yè)電極施加負(fù)電壓以使表面排斥帶負(fù)電荷的DNA(步驟2)。用包 含一種核苷酸（例如dATP)的溶液孵育表面（步驟3)。如果dNTP與沿著緊靠單鏈/雙鏈 鏈結(jié)的模板DNA的即將到來的未配對核苷酸互補，則其會被聚合酶合并，如圖1中附圖標(biāo)記 118所示。因此，PL強(qiáng)度會增加特性值A(chǔ)PL，如可參見圖3中的PL圖。原因如下。在使用 PL標(biāo)記聚合酶的情況下，如圖Ia示例的，聚合酶使100/104的雙鏈部分延伸并運動遠(yuǎn)離淬 滅表面對于每個并入dNTP的一個堿基對間隔的距離。所述堿基對間隔為近似0.34nm。對 于圖5和圖6這意味著，h(n+l) =h(n)+0. 34nm。隨著聚合酶結(jié)合PL標(biāo)記與淬滅層之間的 距離h增加，非放射性能量轉(zhuǎn)移減少，并且因此PL發(fā)射增加A PL。
[0134] 如圖Ib示例的，在PL標(biāo)記DNA的情況下，聚合酶使100/104的雙鏈部分延伸，并 且從而模板DNA 100的靈活單鏈部分的固定點，即鏈結(jié)運動遠(yuǎn)離表面，參見圖5和6。我們 分別注意到PL標(biāo)記117的位置沒有完全固定就位，但是可經(jīng)受靈活單鏈DNA片段的布朗波 動。但是這對本發(fā)明沒有影響。因此，所測量的PL強(qiáng)度對應(yīng)于淬滅層上方PL標(biāo)記的時間 平均高度h。隨著豎直對齊的雙鏈DNA片段延伸，單鏈片段的固定點向上運動；這有效地轉(zhuǎn) 化成PL標(biāo)記的時間平均高度的增加，這可被本發(fā)明用來檢測結(jié)合事件。
[0135] 如果由于同質(zhì)核苷酸沿模板DNA的伸展，dNTP被并入多次，則如圖3中所示PL強(qiáng) 度會增加相應(yīng)的多個A PL(2X A PL、3X APL等）。如果dNTP失配，則與圖3相比PL強(qiáng)度 保持不變。另外，通過用無dNTP緩沖液交換溶液來移除未結(jié)合的dNTP(步驟4)。用不同 類型的核苷酸（例如dCTP、dGTP、dTTP)重復(fù)之前的步驟2到4(步驟5)。此外，重復(fù)步驟 2到5直到PL強(qiáng)度對于任何類型的dNTP都不再變化，也就是說，全部模板DNA鏈已經(jīng)從單 鏈轉(zhuǎn)化為雙鏈。因此，使用者得到模板100的完整序列。測序裝置可使用信號102來根據(jù) 觀察到的信號A或2 A或3 A的改變檢測dNTP到模板核酸100中的每次結(jié)合，其中信號 的改變是由dNTP的結(jié)合導(dǎo)致的標(biāo)記到淬滅介質(zhì)的距離103的改變引起的。
[0136] 圖4示出根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的測序方法的流程圖。示出了用于對模板核 酸測序的方法，所述模板核酸固定化在基底上，其中標(biāo)記與模板核酸共價或非共價結(jié)合，并 且其中核酸引物退火到所述模板核酸。此外，提供用于淬滅標(biāo)記的信號的一種淬滅介質(zhì)。 所述方法包括用包含多個第一類型S5核苷酸的溶液孵育基底的步驟。這可被視為添加核 苷酸的步驟。另外，用Sl示出至少在添加核苷酸之前和之后觀察標(biāo)記的信號的步驟。在第 一種情況下，第一類型的dNTP與沿著緊靠單鏈/雙鏈鏈結(jié)的模板核酸的即將到來的未配對 核酸是互補的，在步驟S6中溶液的核苷酸結(jié)合到模板核酸中。第一種情況示出于圖4中左 偵k在第一種情況下，在步驟S7中檢測由于核苷酸的結(jié)合所導(dǎo)致的信號的增加，其中信號 的改變是由核苷酸結(jié)合到模板中導(dǎo)致的標(biāo)記到淬滅介質(zhì)的距離的改變引起的。在第二種情 況下，第一類型的dNTP與即將到來的未配對核酸不互補，并且其中核苷酸未結(jié)合，在步驟 S8中檢測未變化信號。在兩種情況下，觀察到的標(biāo)記的信號是用于根據(jù)步驟S2中觀察到的 信號的改變來檢測核苷酸結(jié)合到模板核酸中。如果需要的話，可在步驟S9中用不同或相同 類型的核苷酸重復(fù)步驟S5到S8。因此，所述方法確定所述核苷酸是否結(jié)合在退火到所述模 板核酸的所述核酸引物的3'端處。
[0137] 圖5示出根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的用光致發(fā)光標(biāo)記標(biāo)記的DNA鏈的測序。圖 6示出用由光致發(fā)光標(biāo)記標(biāo)記的聚合酶測序。圖5和圖6中標(biāo)記117到淬滅介質(zhì)107的距 離103的改變是由核苷酸501或601的結(jié)合引起的。用附圖標(biāo)記500和600表示核苷酸的 添加。模板100中堿基之間的堿基對間隔為近似〇. 34nm。圖5和圖6中包括模板100和具 有n個核苷酸的引物104的鏈的高度h為h (n)。因此在一個匹配核苷酸dNTP結(jié)合之后，高 度為h(n+l)。因此，h(n+l) =h(n)+0. 34nm。隨著聚合酶結(jié)合標(biāo)記與淬滅層之間的距離h 增加，非放射性能量轉(zhuǎn)移減少，并且因此信號發(fā)射強(qiáng)度改變A。
[0138] 圖7示出根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的在全體測量中核苷酸結(jié)合過程中的時間 依賴光致發(fā)光信號。圖7涉及核苷酸結(jié)合速率和區(qū)分修改的核苷酸?？赏ㄟ^跟循例如實時 PL測量中雙鏈DNA片段的以聚合酶為中介的延伸來確定不同dNTP的結(jié)合速率，例如圖7所 示。dNTP孵育和信號飽和之間的穩(wěn)定PL增加取決于dNTP濃度，其可根據(jù)所使用的PL檢測 裝置的取樣時間進(jìn)行調(diào)整。重要地，其也取決于用于相應(yīng)dNTP的聚合酶的持續(xù)合成能力。 在限速反應(yīng)機(jī)制中，信號隨指數(shù)時間進(jìn)程變化PL~exp (-kdNTPXt)，其中kdNTP為聚合酶 對于給定dNTP的結(jié)合速率。根據(jù)本實施例該dNTP具體結(jié)合速率可用來區(qū)分不同dNTP。特 別地，測量特性結(jié)合速率或者相反地測量結(jié)合時間常數(shù)使能夠區(qū)分沿模板DNA鏈的核苷酸 是否已經(jīng)被化學(xué)改性，例如如果它們已在后生過程的進(jìn)程中被甲基化，或者已被損壞。這是 由于聚合酶的持續(xù)合成能力一般依賴于待合并核苷酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)，和模板DNA鏈上對應(yīng)未 配對核苷酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。本方法利用了上述內(nèi)容。本文公開的用于測序的裝置能夠檢測是 否觀察到常規(guī)結(jié)合時間或者是否觀察到不同的結(jié)合時間。如果需要的話，可與默認(rèn)結(jié)合時 間進(jìn)行比較。
[0139] 此外，通過測量結(jié)合時間常數(shù)，也可確定溶解的dNTP結(jié)合到DNA鏈中的頻繁程度， 即，計量同質(zhì)核苷酸沿模板延伸的長度。我們通過實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)合時間用同質(zhì)核苷酸片段內(nèi) 的核苷酸數(shù)目衡量。除了測量信號強(qiáng)度的絕對變化（見圖3中APL)，結(jié)合時間的測量提供 同質(zhì)核苷酸片段的長度上的互補信息，其改進(jìn)確定的準(zhǔn)確程度。本方法也可利用該內(nèi)容。
[0140] 以上描述的測量形式可應(yīng)用到對以下的研究：(A)DNA模板克隆的全體和（B)單個 分子。
[0141] (A)對于全體測量，可通過規(guī)定程序在單個表面上產(chǎn)生很多例如多達(dá)幾十億的單 克隆DNA群落，也稱作"聚合酶克?。╬olonies)"，例如通過橋式放大方法或類似方法。圖 3和7中描繪了典型測量信號。
[0142] (B)對于單DNA分子的測序，捕捉寡核苷酸以極其低的密度固定化在電極表面上， 使得兩個相鄰DNA之間的距離大于光學(xué)成像系統(tǒng)的橫向空間分辨率（通常為0. 5 ym)。在 實踐中其可通過以下實現(xiàn)：（i)在固定化溶液中使用非常稀的寡核苷酸濃度，和/或（ii) 采用電氣手段稀釋表面的DNA密度，如之前所述的，和/或（iii)使用僅能夠容納單個DNA 分子的亞微米橫向尺寸的非常小的電極結(jié)構(gòu)。單分子測量需要使用不易于光致退色的穩(wěn)定 PL標(biāo)記。因此，優(yōu)選使用非退色半導(dǎo)體納米晶體或高光穩(wěn)定有機(jī)熒光團(tuán)。也可用多種PL標(biāo) 記進(jìn)行標(biāo)記。此外，通過淬滅金層提高了光致退色穩(wěn)定性。
[0143] 根據(jù)圖7所示的觀察到的數(shù)據(jù)，本發(fā)明的實施例可執(zhí)行以下步驟。確定標(biāo)記所發(fā) 出的時間平均信號，即步驟S3,比較時間平均信號與孵育之前時間點的信號，即步驟S4,并 且根據(jù)比較結(jié)果執(zhí)行之前描述的確定步驟b)。
[0144] 圖8示意性示出單分子水平的核苷酸結(jié)合。圖8中示出單分子測量的PL蹤跡。 與在圖7的全體測量中觀察到的穩(wěn)定增加信號相比，在單分子情況下匹配dNTP的結(jié)合導(dǎo)致 PL強(qiáng)度突然跳躍特性值A(chǔ) PL。栗送dNTP溶液跨過表面即孵育開始與PL強(qiáng)度的實際跳躍 之間的時間跨度反映單個dNTP結(jié)合到單個DNA模板中的時間。其是隨機(jī)變量，期望值對應(yīng) 于全體結(jié)合時間，t-1 = concdNTPXkdNTP。類似于以上對全體測量中結(jié)合速率確定的討論，可 從單分子結(jié)合時間跨度推出不同的，即化學(xué)改性核苷酸的存在。但是，由于單個dNTP結(jié)合 的隨機(jī)屬性，只有在結(jié)合時間的期望值顯著不同，即大于一個數(shù)量級時，才能夠通過它們的 不同單個分子結(jié)合時間合理地區(qū)分兩種不同核苷酸。本發(fā)明公開的測序裝置能夠檢測這種 不同。
[0145] 下文中解釋有關(guān)聚合酶結(jié)合速率和解離速率的確定的方面。之前描述的包括測 序裝置和器皿的實驗裝置允許確定聚合酶與DNA序列的結(jié)合速率常數(shù)MP解離速率常數(shù) k rff。在下文中以下圖表描繪聚合酶與DNA序列的結(jié)合速率常數(shù)MP解離速率常數(shù)k
[0147] 為了此目的，隨時間記錄信號強(qiáng)度。根據(jù)圖1中的情況，當(dāng)由于聚合酶上存在的標(biāo) 記使聚合酶結(jié)合到DNA引物區(qū)域時，信號強(qiáng)度從零或者背景強(qiáng)度增加?？赏ㄟ^將分析交互 模型應(yīng)用到時間分辨結(jié)合曲線和解離曲線可確定動力學(xué)速率常數(shù)，并且可通過分析的速率 常數(shù)K a= I^ykciff或者通過濃度依賴滴定法確定親和常數(shù)。因此本發(fā)明提出的測序裝置，例 如提供的計算單元，可執(zhí)行該方法。
[0148] 圖9示出根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的用懸垂有失配dNTP(圖9b)和匹配 dNTP (圖9c)的3-核苷酸單鏈孵育表面固定化雙鏈DNA序列（圖9a)。以下將會描述更 多證實本發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)。圖9的數(shù)據(jù)屬于圖Ib中描繪的情況，即用標(biāo)記DNA鏈進(jìn)行檢 測。將市場上能夠獲得的來自New England Biolabs的Bst DNA聚合酶用作聚合酶。但 這只是一種示例性實施例。圖9示出用于混合具有42個堿基對的隨機(jī)DNA序列與懸垂在 表面遠(yuǎn)端處的單鏈3個核苷酸，即TTT的數(shù)據(jù)。DNA 104和105在溶液中預(yù)雜交并且之后 經(jīng)由兩個…_(CH2)6_SH鏈結(jié)123結(jié)合到表面，并且將巰基己醇（H0-(CH2)6-SH)用作SAM 109。本文之前已經(jīng)描述了方案。熒光團(tuán)Cy3被用作標(biāo)記和發(fā)射體117。作為負(fù)控制，用 IyM dGTP(Fig. 9b)孵育表面。由于G與第一未配對核苷酸T不能形成堿基對（在位置 43處），Cy3熒光團(tuán)強(qiáng)度保持恒定，也就是說，G未結(jié)合并且dsDNA片段未延伸。當(dāng)用I y M dATP (Fig. 9c)孵育表面固定化DNA時，熒光增強(qiáng)+31 %，其中所述I y M dATP對于位置43、 44、45處的3個未配對T是匹配互補核苷酸。該增強(qiáng)歸因于3個A的結(jié)合和dsDNA片段延 長了3個堿基對。熒光增加支撐圖5中描繪和本文之前已經(jīng)解釋的方案。實線是單個指數(shù) 擬合，其與圖7中描繪的方案一致，得到結(jié)合速率常數(shù)kdATP= (0.029±0.001)s i。
[0149] 因此，基于圖9提供了一種方法，其至少在添加核苷酸之前和之后觀察標(biāo)記的信 號并利用所觀察到的標(biāo)記的信號根據(jù)所觀察到的標(biāo)記的信號的改變檢測核苷酸結(jié)合到模 板核酸中。這里，信號的改變是由核苷酸結(jié)合到模板核酸中導(dǎo)致的標(biāo)記到淬滅介質(zhì)的距離 的變化引起的。
[0150] 圖10示出根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的單個dNTP的結(jié)合。圖10示出單個核苷 酸結(jié)合到類似于圖9a中構(gòu)造但是具有單鏈懸垂的15個核苷酸的DNA中的數(shù)據(jù)。在用I yM dGTP溶液孵育時（t~1. 2分鐘），Cy3熒光增加+12%。該熒光增加對應(yīng)于從圖9C中三個 dNTP的結(jié)合觀察到的熒光增加的三分之一，其為+31 %。這支撐圖3中描繪的方案，也就是 PL變化的量用結(jié)合核苷酸的數(shù)量衡量。
[0151] 圖11示出根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的，沿著用所有4個dNTP的混合物孵育的 45nt DNA序列的25nt單鏈