多功能的經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多功能的經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)方法，特別涉及一種從經(jīng)血中提取并培養(yǎng)經(jīng)血干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近眾所周知，子宮內(nèi)膜細(xì)胞系具有很強(qiáng)的自我更生能力，在每個月經(jīng)周期都會有組織和血管的大量增長，這一增長過程會隨著月經(jīng)的來臨而終止繼而形成經(jīng)血。經(jīng)血是女性血液和一些脫落的子宮內(nèi)膜、子宮頸粘液及陰道分泌物的混雜液體。近年來，美國的研究小組和日本的研究小組利用女性經(jīng)血成功分離培養(yǎng)出具有多向分化功能的干細(xì)胞，并將該細(xì)胞命名為子宮內(nèi)膜經(jīng)血源間充質(zhì)干細(xì)胞其，簡稱經(jīng)血干細(xì)胞，其擴(kuò)增能力是自體骨髓干細(xì)胞的30倍，而且在神經(jīng)修復(fù)、抑制腫瘤和美容抗衰老等方面具有非常顯著的作用，因此有望用來治療損傷和衰老的組織。同時經(jīng)血的獲得不具有侵入性不會對供者造成傷害，不僅來源廣泛，且對其研究不會涉及倫理道德和法律問題。此外，經(jīng)血干細(xì)胞還具有采集方便、易于體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和誘導(dǎo)等特性，被認(rèn)為是干細(xì)胞研究的一種理想種子細(xì)胞，因此成為尋找人類干細(xì)胞新來源及提高臨床應(yīng)用效果的研究熱點(diǎn)。
[0003]由于子經(jīng)血干細(xì)胞研究是近幾年才開始，與之配套的培養(yǎng)體系還不成熟，目前體外擴(kuò)增培養(yǎng)體系中一般都含有一定濃度的胎牛血清，使用濃度至少10%才能保證細(xì)胞的正常生長傳代。然而，經(jīng)血干細(xì)胞在高濃度血清培養(yǎng)時，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞增殖能力下降，形態(tài)由長梭形變?yōu)閷挻蟊馄剑饾u喪失多向分化能力。另外，動物血清可能存在動物攜帶的潛在病毒或支原體污染，對以后可能的臨床應(yīng)用構(gòu)成威脅。盡管有些研究人員嘗試了一些無血清培養(yǎng)基方案，但經(jīng)血干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中普遍存在生長緩慢，多向分化能力逐漸消失的問題，所以，急需開發(fā)一種安全、穩(wěn)定、快速、高質(zhì)量擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的提供一種多功能的經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)方法，通過經(jīng)血和血漿的采集階段、經(jīng)血的除菌清洗階段、經(jīng)血的過濾階段、自體血漿的制備階段、單個核細(xì)胞的分離階段、經(jīng)血干細(xì)胞的培養(yǎng)階段、經(jīng)血干細(xì)胞的純化及擴(kuò)增階段和經(jīng)血干細(xì)胞的凍存階段，由此本發(fā)明一是解決了現(xiàn)有技術(shù)必須用高濃度的胎牛血清培養(yǎng)帶來的各種弊端，二是用客戶自己的血漿培養(yǎng)自己的細(xì)胞，更讓其自身覺得安全且易接受，真正實(shí)現(xiàn)了一種安全、穩(wěn)定、快速、高質(zhì)量擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系。
[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供了一種多功能的經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)方法的解決方案，具體如下:
[0006]一種多功能的經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)方法，步驟如下:
[0007]步驟1:經(jīng)血和血漿的采集階段，該階段具體為:采用經(jīng)血采集器采集經(jīng)血，并將經(jīng)血迅速轉(zhuǎn)移到裝有保存液的無菌離心管中，在溫度為4°C的條件下保存，空腹抽取20-30ml靜脈血置入抗凝容器里，在溫度為4°C的條件下保存72h后，以此用于自體血漿的制備；
[0008]步驟2:經(jīng)血的除菌清洗階段，該階段具體為:在48h內(nèi)將浸泡在經(jīng)血保存液中的經(jīng)血運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，將經(jīng)血和保存液充分混勻，首次離心為800-1000g/10-15min，除去上清，再次加入清洗液，充分混勻，再次離心為300-700g/10-15min，除去上清；
[0009]步驟3:經(jīng)血的過濾階段，該階段具體為:將經(jīng)過步驟2后所得的經(jīng)血用清洗液I: I混合，充分混勻后用100 μ m細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，以去除大部分粘液及凝塊；
[0010]步驟4:自體血漿的制備階段，該階段具體為:將步驟I中所抽取的靜脈血200g-400g/min離心8?12min，血液分層，取上層液體部分得到富含血小板的血楽，將所述富含血小板的血漿在溫度為2?8°C的條件下保存I?7天備用或在溫度為-75?-85°C的條件下長期保存?zhèn)溆茫?br>[0011]步驟5:單個核細(xì)胞的分離階段，該階段具體為:將步驟3中稀釋的經(jīng)血加入人淋巴細(xì)胞分離液之上，在溫度為18-25°C的條件下700-1000g離心15-20分鐘；吸取中央白膜層細(xì)胞即單個核細(xì)胞，將單個核細(xì)胞吸至另一潔凈離心管中，加入PBS重復(fù)離心洗滌2-3次；收集底部單個核細(xì)胞沉淀
[0012]步驟6:經(jīng)血干細(xì)胞的培養(yǎng)階段，該階段具體為:用完全培養(yǎng)基重懸上述單個核細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以IX 16細(xì)胞/ml的密度接種至T75(75cm2)培養(yǎng)瓶中，置于溫度為37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，以獲取經(jīng)血干細(xì)胞；
[0013]步驟7:經(jīng)血干細(xì)胞的純化及擴(kuò)增階段，該階段具體為:貼壁培養(yǎng)所述單個核細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)48-72h后更換完全培養(yǎng)基以棄除未貼壁細(xì)胞，初次換液后每天觀察細(xì)胞的生長情況，每2-3天半量換液一次。使細(xì)胞擴(kuò)增得到純化的經(jīng)血干細(xì)胞；
[0014]步驟8:經(jīng)血干細(xì)胞的凍存階段，該階段具體為:當(dāng)擴(kuò)增的經(jīng)血干細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1-2*108細(xì)胞時，按每10 6_107細(xì)胞加入0.5-lml凍存液，放入凍存盒采用程序降溫，4度l-2h，-20度l-2h，轉(zhuǎn)入-80°C冰箱，12?24h后轉(zhuǎn)入_196°C液氮保存?zhèn)溆谩?br>[0015]所述的步驟I和步驟2中的保存液為0.9%生理鹽水或者PBS，加入相應(yīng)的抗生素和抗凝劑，抗生素濃度為終濃度為0.5-3%的青霉素和鏈霉素、終濃度為l-10ug/ml的兩性霉素B和肝素。
[0016]所述的步驟2和步驟3中的清洗液為理鹽水或者PBS，加入相應(yīng)青霉素、鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素，其中青霉素和鏈霉素為0.5-3%的終濃度，兩性霉素B為l-10ug/ml的終濃度，慶大霉素為100-200U/ml的終濃度。
[0017]所述的步驟6和步驟7中的完全培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基α -MEM,含有5 %的富含血小板的血漿、10ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子、80U/ml慶大霉素。
[0018]所述步驟8中的凍存液由80 %基礎(chǔ)培養(yǎng)基a -MEM, 9 %自體血漿，I %的氨基酸，10%的二甲基亞砜組成。
[0019]本發(fā)明通過培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜經(jīng)血源間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定，可知:
[0020]I)形態(tài)特征:置于倒置顯微鏡下拍照，細(xì)胞形狀為短梭形，大小均一；
[0021]2)經(jīng)血干細(xì)胞表面標(biāo)志:用直接免疫熒光法檢測以上得到的梭形細(xì)胞的表面標(biāo)志的表達(dá)，細(xì)胞用藻紅蛋白(PE)⑶44和異硫氰酸熒光素(FITC)⑶34標(biāo)記后進(jìn)行流式檢測，流式細(xì)胞儀為BD FACScan (Becton Dickinson)。結(jié)果表明這種梭形細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志⑶44，不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志⑶34 ；
[0022]3)經(jīng)血干細(xì)胞的多能性:經(jīng)血干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化及油紅O染色檢測；經(jīng)血干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化及茜素紅染色檢測。說明干細(xì)胞亞群可在體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明的實(shí)施例1的形態(tài)特征的效果圖；
[0024]圖2為本發(fā)明的實(shí)施例1的經(jīng)血干細(xì)胞表面標(biāo)志的效果圖；
[0025]圖3為本發(fā)明的實(shí)施例1的誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞的效果圖；
[0026]圖4為本發(fā)明的實(shí)施例1的誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明所用的自體血漿采用分次低劑量抽血，分次提取自體血漿，這樣避免一次大劑量抽血對客戶造成精神上及身體上的負(fù)擔(dān)。具體為采經(jīng)血時抽取客戶30ml靜脈血，分離其中的血漿，其中的2/3的血漿用于經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)及初步擴(kuò)增，1/3血漿-20度凍存以備后續(xù)經(jīng)血源干細(xì)胞培養(yǎng)及儲存時用，細(xì)胞少量擴(kuò)增后分裝凍存，以后根據(jù)客戶的應(yīng)用分次抽取客戶自體血漿擴(kuò)增培養(yǎng)其自體細(xì)胞。
[0028]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步說明:
[0029]實(shí)施例1:
[0030]多功能的經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)方法，步驟如下:
[0031]步驟1:經(jīng)血和血漿的采集階段，該階段具體為:采用經(jīng)血采集器采集經(jīng)血，選用的經(jīng)血采集器應(yīng)該具有對女性外陰無創(chuàng)傷，使用方便，不易受污染，成本低廉，為下一步提取干細(xì)胞提供了高質(zhì)量的保證，并將經(jīng)血迅速轉(zhuǎn)移到裝有保存液的無菌離心管中，在溫度為4°C的條件下保存，空腹抽取20ml靜脈血置入抗凝容器里，在溫度為4°C的條件下保存72h后，以此用于自體血漿的制備；
[0032]步驟2:經(jīng)血的除菌清洗階段，該階段具體為:在48h內(nèi)將浸泡在經(jīng)血保存液中的經(jīng)血運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，將經(jīng)血和保存液充分混勻，首次離心為800g/10min，除去上清，再次加入清洗液，充分混勾，再次離心為300g/10min，除去上清；
[0033]步驟3:經(jīng)血的過濾階段，該階段具體為:將經(jīng)過步驟2后所得的經(jīng)血用清洗液I: I混合，充分混勻后用100 μ m細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，以去除大部分粘液及凝塊；
[0034]步驟4:自體血漿的制備階段，該階段具體為:將步驟I中所抽取的靜脈血200g/min離心8min，血液分層，取上層液體部分得到富含血小板的血楽，將所述富含血小板的血漿在溫度為2°C的條件下保存I天備用或在溫度為_75°C的條件下長期保存?zhèn)溆茫?br>[0035]步驟5:單個核細(xì)胞的分離階段，該階段具體為:將步驟3中稀釋的經(jīng)血加入人淋巴細(xì)胞分離液之上，在溫度為18°C的條件下700g離心15分鐘；吸取中央白膜層細(xì)胞即單個核細(xì)胞，將單個核細(xì)胞吸至另一潔凈離心管中，加入PBS重復(fù)離心洗滌2次；收集底部單個核細(xì)胞沉淀；
[0036]步驟6:經(jīng)血干細(xì)胞的培