血漿的制備；
[0074]步驟2:經(jīng)血的除菌清洗階段，該階段具體為:在48h內(nèi)將浸泡在經(jīng)血保存液中的經(jīng)血運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，將經(jīng)血和保存液充分混勻，首次離心為1000g/15min，除去上清，再次加入清洗液，充分混勾，再次離心為700g/15min，除去上清；
[0075]步驟3:經(jīng)血的過濾階段，該階段具體為:將經(jīng)過步驟2后所得的經(jīng)血用清洗液I: I混合，充分混勻后用100 μ m細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，以去除大部分粘液及凝塊；
[0076]步驟4:自體血漿的制備階段，該階段具體為:將步驟I中所抽取的靜脈血400g/min離心12min，血液分層，取上層液體部分得到富含血小板的血楽，將所述富含血小板的血漿在溫度為8°C的條件下保存7天備用或在溫度為_85°C的條件下長期保存?zhèn)溆茫?br>[0077]步驟5:單個(gè)核細(xì)胞的分離階段，該階段具體為:將步驟3中稀釋的經(jīng)血加入人淋巴細(xì)胞分離液之上，在溫度為25°C的條件下100g離心20分鐘；吸取中央白膜層細(xì)胞即單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞吸至另一潔凈離心管中，加入PBS重復(fù)離心洗滌3次；收集底部單個(gè)核細(xì)胞沉淀
[0078]步驟6:經(jīng)血干細(xì)胞的培養(yǎng)階段，該階段具體為:用完全培養(yǎng)基重懸上述單個(gè)核細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以IX 16細(xì)胞/ml的密度接種至T75(75cm2)培養(yǎng)瓶中，置于溫度為37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，以獲取經(jīng)血干細(xì)胞；
[0079]步驟7:經(jīng)血干細(xì)胞的純化及擴(kuò)增階段，該階段具體為:貼壁培養(yǎng)所述單個(gè)核細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)72h后更換完全培養(yǎng)基以棄除未貼壁細(xì)胞，初次換液后每天觀察細(xì)胞的生長情況，每3天半量換液一次。使細(xì)胞擴(kuò)增得到純化的經(jīng)血干細(xì)胞；
[0080]步驟8:經(jīng)血干細(xì)胞的凍存階段，該階段具體為:當(dāng)擴(kuò)增的經(jīng)血干細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1-2*108細(xì)胞時(shí)，按每10 7細(xì)胞加入Iml凍存液，放入凍存盒采用程序降溫，4度2h，-20度2h,轉(zhuǎn)入-80°C冰箱，24h后轉(zhuǎn)入-196 °C液氮保存?zhèn)溆谩?br>[0081]所述的步驟I和步驟2中的保存液為0.9%生理鹽水或者PBS，加入相應(yīng)的抗生素和抗凝劑，抗生素濃度為終濃度為3%的青霉素和鏈霉素、終濃度為10ug/ml的兩性霉素B和肝素。
[0082]所述的步驟2和步驟3中的清洗液為理鹽水或者PBS，加入相應(yīng)青霉素、鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素，其中青霉素和鏈霉素為3%的終濃度，兩性霉素B為10ug/ml的終濃度，慶大霉素為200U/ml的終濃度。
[0083]所述的步驟6和步驟7中的完全培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基α -MEM,含有5 %的富含血小板的血漿、10ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子、80U/ml慶大霉素。
[0084]所述步驟8中的凍存液由80 %基礎(chǔ)培養(yǎng)基a -MEM, 9 %自體血楽，I %的氨基酸，10%的二甲基亞砜組成。
[0085]對實(shí)施例3所得的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜經(jīng)血源間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
[0086]I)形態(tài)特征:置于倒置顯微鏡下拍照，細(xì)胞形狀為短梭形，大小均一；
[0087]2)經(jīng)血干細(xì)胞表面標(biāo)志:用直接免疫熒光法檢測以上得到的梭形細(xì)胞的表面標(biāo)志的表達(dá)，細(xì)胞用藻紅蛋白(PE)⑶44和異硫氰酸熒光素(FITC)⑶34標(biāo)記后進(jìn)行流式檢測，流式細(xì)胞儀為BD FACScan (Becton Dickinson)。結(jié)果表明這種梭形細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志⑶44，不表造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志⑶34。
[0088](3)經(jīng)血干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化及油紅O染色檢測
[0089]細(xì)胞傳至第3代時(shí)將其以2X107/L的細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)后不同時(shí)間段，對成脂誘導(dǎo)組進(jìn)行油紅O脂肪顆粒染色。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含:基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM，10%胎牛血清、0.5mM IBMX(isobulyl-l-methylxanth1ne)、0.ImM消炎痛、IuM地塞米松。在第6天、第12天和第16天分別進(jìn)行油紅O染色。結(jié)果顯示:培養(yǎng)12天可見到折光度增加的液泡充滿整個(gè)細(xì)胞；油紅O染色發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)中約60?80%細(xì)胞富含脂肪滴說明干細(xì)胞亞群可在體外誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞。
[0090](4)經(jīng)血干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化及茜素紅染色檢測
[0091]取第三代經(jīng)血干細(xì)胞，培養(yǎng)在6孔板中，待細(xì)胞長到80%左右時(shí)換用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，誘導(dǎo)液的成分包含:基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM，10%胎牛血清、ΙΟΜπιβ -磷酸甘油、0.1mM抗壞血酸磷酸鹽Vc、0.1uM地塞米松。每三天換液，培養(yǎng)3周，于2周、3周分別進(jìn)行茜素紅染色觀察。結(jié)果顯示:成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)中細(xì)胞形態(tài)由原來的梭形變成了立方形，隨著細(xì)胞生長密度的增長形成多層的結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)，而對照組中細(xì)胞仍是梭形且呈單層生長；2周之后已有礦化結(jié)節(jié)形成了，3周后結(jié)節(jié)比較多，染色比較明顯。說明干細(xì)胞亞群可在體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。
[0092]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種多功能的經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟如下: 步驟1:經(jīng)血和血漿的采集階段，該階段具體為:采用經(jīng)血采集器采集經(jīng)血，并將經(jīng)血迅速轉(zhuǎn)移到裝有保存液的無菌離心管中，在溫度為4°c的條件下保存，空腹抽取20-30ml靜脈血置入抗凝容器里，在溫度為4°C的條件下保存72h后，以此用于自體血漿的制備； 步驟2:經(jīng)血的除菌清洗階段，該階段具體為:在48h內(nèi)將浸泡在經(jīng)血保存液中的經(jīng)血運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，將經(jīng)血和保存液充分混勻，首次離心為800-1000g/10-15min，除去上清，再次加入清洗液，充分混勻，再次離心為300-700g/10-15min，除去上清； 步驟3:經(jīng)血的過濾階段，該階段具體為:將經(jīng)過步驟2后所得的經(jīng)血用清洗液1:1混合，充分混勻后用100 μ m細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，以去除大部分粘液及凝塊； 步驟4:自體血漿的制備階段，該階段具體為:將步驟I中所抽取的靜脈血200g-400g/min離心8?12min，血液分層，取上層液體部分得到富含血小板的血楽，將所述富含血小板的血漿在溫度為2?8°C的條件下保存I?7天備用或在溫度為-75?_85°C的條件下長期保存?zhèn)溆茫? 步驟5:單個(gè)核細(xì)胞的分離階段，該階段具體為:將步驟3中稀釋的經(jīng)血加入人淋巴細(xì)胞分離液之上，在溫度為18-25°C的條件下700-1000g離心15-20分鐘；吸取中央白膜層細(xì)胞即單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞吸至另一潔凈離心管中，加入PBS重復(fù)離心洗滌2-3次；收集底部單個(gè)核細(xì)胞沉淀 步驟6:經(jīng)血干細(xì)胞的培養(yǎng)階段，該階段具體為:用完全培養(yǎng)基重懸上述單個(gè)核細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以IX 16細(xì)胞/ml的密度接種至T75(75cm2)培養(yǎng)瓶中，置于溫度為37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，以獲取經(jīng)血干細(xì)胞； 步驟7:經(jīng)血干細(xì)胞的純化及擴(kuò)增階段，該階段具體為:貼壁培養(yǎng)所述單個(gè)核細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)48-72h后更換完全培養(yǎng)基以棄除未貼壁細(xì)胞，初次換液后每天觀察細(xì)胞的生長情況，每2-3天半量換液一次。使細(xì)胞擴(kuò)增得到純化的經(jīng)血干細(xì)胞； 步驟8:經(jīng)血干細(xì)胞的凍存階段，該階段具體為:當(dāng)擴(kuò)增的經(jīng)血干細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1-2*108細(xì)胞時(shí)，按每10 6_107細(xì)胞加入0.5-lml凍存液，放入凍存盒采用程序降溫，4度l-2h，-20度l-2h，轉(zhuǎn)入-80°C冰箱，12?24h后轉(zhuǎn)入_196°C液氮保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能的經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟I和步驟2中的保存液為0.9%生理鹽水或者PBS，加入相應(yīng)的抗生素和抗凝劑，抗生素濃度為終濃度為0.5-3%的青霉素和鏈霉素、終濃度為l-10ug/ml的兩性霉素B和肝素。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能的經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟2和步驟3中的清洗液為理鹽水或者PBS，加入相應(yīng)青霉素、鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素，其中青霉素和鏈霉素為0.5-3%的終濃度，兩性霉素B為l-10ug/ml的終濃度，慶大霉素為100-200U/ml的終濃度。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能的經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟6和步驟7中的完全培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基α -ΜΕΜ，含有5%的富含血小板的血漿、10ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子、80U/ml慶大霉素。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能的經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟8中的凍存液由80%基礎(chǔ)培養(yǎng)基α -MEM, 9%自體血漿，I %的氨基酸，10%的二甲基亞砜組成。
【專利摘要】一種多功能的經(jīng)血干細(xì)胞培養(yǎng)方法，通過經(jīng)血和血漿的采集階段、經(jīng)血的除菌清洗階段、經(jīng)血的過濾階段、自體血漿的制備階段、單個(gè)核細(xì)胞的分離階段、經(jīng)血干細(xì)胞的培養(yǎng)階段、經(jīng)血干細(xì)胞的純化及擴(kuò)增階段和經(jīng)血干細(xì)胞的凍存階段，由此本發(fā)明一是解決了現(xiàn)有技術(shù)必須用高濃度的胎牛血清培養(yǎng)帶來的各種弊端，二是用客戶自己的血漿培養(yǎng)自己的細(xì)胞，更讓其自身覺得安全且易接受，真正實(shí)現(xiàn)了一種安全、穩(wěn)定、快速、高質(zhì)量擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系。
【IPC分類】C12N5/074
【公開號】CN105112358
【申請?zhí)枴緾N201510566727
【發(fā)明人】王泰華
【申請人】東莞賽爾生物科技有限公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年9月8日