檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米mon810和mir604的多重dpo-pcr引物組合及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和 MIR604的多重DP0-PCR引物組合及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多重PCR是指在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)加入多對(duì)引物同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，可以 實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的高通量檢測(cè)，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因物種的檢測(cè)。由于在PCR反 應(yīng)體系內(nèi)加入了多對(duì)引物，體系復(fù)雜，穩(wěn)定性不高，限制了其使用。DP0(Dualpriming oligonucleotide)引物技術(shù)的主要原理為其引物包含兩個(gè)各自獨(dú)立的特異性引物區(qū)域， 5'端序列由18-25個(gè)堿基組成并與靶基因序列配對(duì)，3'端序列由6-12個(gè)堿基用來(lái)引導(dǎo) PCR反應(yīng)的特異性延伸，這兩段獨(dú)立的特異性區(qū)域利用寡聚次黃嘌呤（In〇Sine，I)進(jìn)行連 接，由于次黃嘌呤比一般堿基的退火溫度低，在退火時(shí)寡聚次黃嘌呤形成類似泡狀的結(jié)構(gòu)， 從而使5'和3'區(qū)域形兩個(gè)獨(dú)立功能的雙特異性引物結(jié)構(gòu)，研究表明5'和3'引物區(qū)域 中任何有3個(gè)及以上堿基的錯(cuò)配，PCR反應(yīng)將不能進(jìn)行，而且由于其特殊的結(jié)構(gòu)，引物自身 以及引物之間很少形成二級(jí)結(jié)構(gòu)且對(duì)退火溫度不敏感。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)主要在于它對(duì)退火 溫度等影響普通多重PCR的關(guān)鍵因素不敏感，適用范圍廣，而且該技術(shù)特異性強(qiáng)，擴(kuò)增效率 高，為多重PCR技術(shù)的應(yīng)用提供了新的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR引物 組合。
[0004] 本發(fā)明的另一目的是提供檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR方 法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604和M0N810的旁側(cè)序列，設(shè)計(jì) 了如下檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR引物組合：
[0006] M0N810-F:5 ' -CTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTIIIIIGCTATCTGTC-3 '(SeqID No. 1)；
[0007] M0N810-R:5，-TAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGAGA-3，（SeqIDNo. 2);
[0008] MIR604-F:5，-GCACGCAATTCAACAGAAGGCGIIIIICGACAATC-3，（SeqIDNo. 3);
[0009] MIR604-R:5，-TGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTIIIIIGGCTTGTC-3，（SeqIDNo. 4);
[0010] 其中，I為次黃嘌呤。
[0011] M0N810-F和M0N810-R為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的引物，產(chǎn)物大小為266bp; MIR604-F和MIR604-R為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的引物，產(chǎn)物大小為127bp。
[0012] 本發(fā)明還提供含有所述引物組合的用于多重DP0-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和 MIR604的試劑盒。
[0013] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg'PCR反應(yīng)緩沖液等中的至 少一種。
[0014] 更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR方法，即利用所 述引物組合進(jìn)行多重DP0-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物。
[0016] 具體地，所述方法包括以下步驟：1)提取待測(cè)轉(zhuǎn)基因作物樣品中的DNA;2)以步驟 1)中提取的DNA為模板，進(jìn)行多重DP0-PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0017] 多重DP0-PCR反應(yīng)體系以50yL計(jì)為：
[0018]
[0019] 其中，Mix1內(nèi)含DNA聚合酶，Mix2內(nèi)含dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液；Mix1和Mix 2購(gòu)自TaKaRa公司，貨號(hào)為RR060A。
[0020] 多重DP0-PCR反應(yīng)條件為：94°C1 分鐘；94°C30 秒，45°C~60°C90 秒，72°C90 秒， 共40個(gè)循環(huán)；72°C10分鐘。
[0021] 優(yōu)選地，多重DP0-PCR反應(yīng)條件為：94°C1分鐘；94°C30秒，60°C90秒，72°C90 秒，共40個(gè)循環(huán)；72°C10分鐘。
[0022] 前述的方法，步驟3)中采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)基因玉米 M0N810的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為266bp，轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為127bp。
[0023] 本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604和M0N810的旁側(cè)序列，分別設(shè)計(jì)特異性DP0-PCR 引物，并基于這些引物建立了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR方法，可實(shí) 現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物樣品的定性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的檢測(cè)方法特異性好、通量高、快速，提 高了檢測(cè)效率，為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604和M0N810的檢測(cè)提供了更有效的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中多重DP0-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果。其中，1 :轉(zhuǎn)基 因玉米MIR604 ;2 :轉(zhuǎn)基因玉米M0N810 ;3 :轉(zhuǎn)基因玉米MIR604、M0N810。
[0025] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中多重DP0-PCR引物組合的靈敏度電泳檢測(cè)結(jié)果。其中， 卜5 :兩種轉(zhuǎn)基因玉米DNA模板量依次為50ng、5ng、0. 5ng、0. 05ng和0? 005ng。
[0026] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中多重DP0-PCR引物組合的退火溫度敏感實(shí)驗(yàn)的電泳檢測(cè) 結(jié)果。其中，1-4 :退火溫度分別為45 °C、50 °C、55 °C和60 °C。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書建議的條件。
[0028] 以下實(shí)施例中使用的轉(zhuǎn)基因玉米M0N810、轉(zhuǎn)基因玉米MIR604、轉(zhuǎn)基因玉米 TC1507、轉(zhuǎn)基因玉米M0N863、轉(zhuǎn)基因玉米BT176、轉(zhuǎn)基因玉米M0N89034、轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1、轉(zhuǎn)基因油菜GT73由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供。
[0029] 實(shí)施例1檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR方法
[0030] 一、多重DP0-PCR引物組合的設(shè)計(jì)
[0031] 根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604和M0N810的旁側(cè)序列，設(shè)計(jì)了如下檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米 M0N810和MIR604的多重DP0-PCR引物組合（引物序列中的I為次黃嘌呤）：
[0032] M0N810-F:5 ' -CTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTIIIIIGCTATCTGTC-3 '(SeqID No. 1)
[0033] M0N810-R:5，-TAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGAGA-3，（SeqIDNo. 2)
[0034] MIR604-F:5，-GCACGCAATTCAACAGAAGGCGIIIIICGACAATC-3，（SeqIDNo. 3)
[0035] MIR604-R:5，-TGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTIIIIIGGCTTGTC-3，（SeqIDNo. 4)
[0036] 其中，M0N810-F和M0N810-R為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的引物，產(chǎn)物大小為 266bp;MIR604-F和MIR604-R為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的引物，產(chǎn)物大小為127bp。
[0037] 二、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR方法
[0038] 1、DNA的提取
[0039] 參照試劑盒說(shuō)明操作（植物基因組DNA提取試劑盒，貨號(hào)為DP305-02,天根生物科 技有限公司）分別提取轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的基因組DNA。
[0040] 2、多重DP0-PCR擴(kuò)增
[0041] 采用M0N810-F、M0N810-R、MIR604-F和MIR604-R共 4 條多重DP0-PCR引物，分別 以如下3組的基因組DNA為模板進(jìn)行多重DP0-PCR擴(kuò)增，分別得到多重DP0-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：
[0042] 組1以轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的基因組DNA為模板；
[0043] 組2以轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的基因組DNA為模板；
[0044] 組3以轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的基因組DNA為模板。
[0045] 多重DP0-PCR反應(yīng)體系如表1所示。其中，Mix2內(nèi)含dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液； Mix1內(nèi)含DNA聚合酶，Mix2和Mix1購(gòu)自TaKaRa公司，貨號(hào)為RR060A。
[0046] 多重DP0-PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性lmin;然后94°C變性30s，60°C退火90s，72°C 延伸90s，在此條件下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72°C再延伸10min。
[0047] 表1多重DP0-PCR反應(yīng)體系
[0048]