r>[0049] 3、多重DP0-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測
[0050] 多重0?〇-?0?反應(yīng)結(jié)束后，取5 1^的多重0?0_?0?擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠 電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。
[0051] 結(jié)果如圖1所示，組1 (轉(zhuǎn)基因玉米M0N810)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有1條帶，大小為 266bp;組2 (轉(zhuǎn)基因玉米MIR604)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只含有1個(gè)條帶，大小為127bp;組3 (轉(zhuǎn) 基因玉米M0N810和MIR604)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有2個(gè)條帶，大小為266bp和127bp。說明 本發(fā)明的多重DP0-PCR引物的可以快速有效地檢測轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604。
[0052] 實(shí)施例2多重DP0-PCR引物的特異性檢測
[0053] 1、DNA的提取
[0054] 參照試劑盒說明操作（植物基因組DNA提取試劑盒，貨號(hào)為DP305-02,天根生物科 技有限公司）分別提取轉(zhuǎn)基因玉米M0N810、轉(zhuǎn)基因玉米MIR604、轉(zhuǎn)基因玉米TC1507、轉(zhuǎn)基因 玉米M0N863、轉(zhuǎn)基因玉米BT176、轉(zhuǎn)基因玉米M0N89034、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因水稻 TT51-1、轉(zhuǎn)基因油菜GT73的基因組DNA。
[0055] 2、多重DP0-PCR擴(kuò)增
[0056] 采用實(shí)施例1中步驟二的檢測轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的方法，分別以步驟 1中提取的9種轉(zhuǎn)基因品系的基因組DNA為模板進(jìn)行多重DP0-PCR擴(kuò)增，得到多重DP0-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0057] 3、多重DP0-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測
[0058] 多重0?〇-?0?反應(yīng)結(jié)束后，分別取5 1^的多重0?0_?0?擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖 凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。
[0059] 結(jié)果如表2所示，從9種樣品中順利檢出轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和轉(zhuǎn)基因玉米 MIR604，其余轉(zhuǎn)基因品系均無擴(kuò)增，說明該方法特異性好。
[0060] 表2多重DP0-PCR檢測轉(zhuǎn)基因樣品的結(jié)果
[0061]

[0063] 實(shí)施例3多重DP0-PCR引物組合的靈敏度檢測
[0064] 1、DNA的提取
[0065] 參照試劑盒說明操作（植物基因組DNA提取試劑盒，貨號(hào)為DP305-02,天根生物 科技有限公司）分別提取轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的基因組DNA。并將得到的基因 組DNA進(jìn)行10倍稀釋，分別制備得到濃度為50ng/yL、5ng/yL、0. 5ng/yL、0. 05ng/yL 和0? 005ng/yL的轉(zhuǎn)基因玉米810的基因組DNA和濃度為50ng/yL、5ng/yL、0. 5ng/yL、 0. 05ng/yL和0. 005ng/yL的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的基因組DNA。
[0066] 2、多重DP0-PCR擴(kuò)增
[0067] 采用實(shí)施例1的步驟二中的檢測轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的方法，分別以如 下5組的基因組DNA為模板進(jìn)行多重DP0-PCR擴(kuò)增，分別得到多重DP0-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：
[0068] 組1 :以50ng/yL的轉(zhuǎn)基因玉米M0N810基因組DNA(1yL)和50ng/yL的轉(zhuǎn)基因 玉米MIR604的基因組DNA(1yL)為模板；
[0069] 組2 :5ng/yL的轉(zhuǎn)基因玉米M0N810基因組DNA(1yL)和5ng/yL的轉(zhuǎn)基因玉米 MIR604的基因組DNA(1yL)為模板；
[0070] 組3 :0? 5ng/yL的轉(zhuǎn)基因玉米M0N810基因組DNA(1yL)和0? 5ng/yL的轉(zhuǎn)基因 玉米MIR604的基因組DNA(1yL)為模板；
[0071] 組4 :0? 05ng/yL的轉(zhuǎn)基因玉米M0N810基因組DNA(1yL)和0? 05ng/yL的轉(zhuǎn)基 因玉米MIR604的基因組DNA(1yL)為模板；
[0072] 組 5 :0? 005ng/yL的轉(zhuǎn)基因玉米M0N810 基因組DNA(1yL)和 0? 005ng/yL的轉(zhuǎn) 基因玉米MIR604的基因組DNA(1yL)為模板。
[0073] 3、多重DP0-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測
[0074] 多重0?〇-?0?反應(yīng)結(jié)束后，分別取5 1^的多重0?0_?0?擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖 凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。
[0075] 結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明多重DP0-PCR引物組合具有較高的靈敏度，可檢測出樣品 中僅含有〇. 5ng的微量DNA。
[0076] 實(shí)施例4多重DP0-PCR引物組合的退火溫度敏感性檢測
[0077] 1、DNA的提取
[0078] 參照試劑盒說明操作（植物基因組DNA提取試劑盒，貨號(hào)為DP305-02,天根生物科 技有限公司）分別提取轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的基因組DNA。
[0079] 2、多重DP0-PCR擴(kuò)增
[0080] 以步驟1獲得的轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的基因組DNA為模板，采用實(shí)施例 1的步驟二中的同時(shí)檢測轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的方法，用不同的退火溫度（45°C、 50°C、55°C、60°C)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其余反應(yīng)條件不變，分別得到多重DP0-PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物。
[0081] 3、多重DP0-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測
[0082] 多重0?〇-?0?反應(yīng)結(jié)束后，分別取5 1^的多重0?0_?0?擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖 凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。
[0083] 結(jié)果如圖3所示：電泳檢測結(jié)果顯示用不同的退火溫度（45°C、50°C、55°C、60°C) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均含有大小為266bp和127bp的片段，無非特異性擴(kuò)增 條帶，說明本發(fā)明的多重DP0-PCR引物對退火溫度不敏感。
[0084] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的多重DPO-PCR引物組合，其特征在于，所述 引物組合如下： M0N810-F：5, -CTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTIIIIIGCTATCTGTC-3,； M0N810-R： 5r -TAGTGGGATTGTGCGTCATCCCT11111CAGTGGAGA-3r ； MIR604-F：5r -GCACGCAATTCAACAGAAGGCGI111ICGACAATC-3r ； MIR604-R：5, -TGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTIIIIIGGCTTGTC-3,； 其中，I為次黃嘌呤。2. 含有權(quán)利要求1所述引物組合的用于多重DPO-PCR檢測轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和 MIR604的試劑盒。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚 合酶、Mg'PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性對照。5. 檢測轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和MIR604的多重DPO-PCR方法，其特征在于，利用權(quán)利要求 1所述的引物組合進(jìn)行多重DPO-PCR檢測轉(zhuǎn)基因作物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取待測轉(zhuǎn)基因作物樣品中的DNA; 2) 以步驟1)中提取的DNA為模板，進(jìn)行多重DPO-PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3) 分析擴(kuò)增產(chǎn)物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，多重DPO-PCR反應(yīng)體系以50yL計(jì)為：其中，Mix1內(nèi)含DNA聚合酶，Mix2內(nèi)含dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液；Mix1和Mix2購 自TaKaRa公司，貨號(hào)為RR060A。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，多重DPO-PCR反應(yīng)條件為：94°C1分鐘； 94°C30 秒，45°C~60°C90 秒，72°C90 秒，共 40 個(gè)循環(huán)；72°C10 分鐘。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，退火溫度為60°C。10. 根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)中采用2%瓊脂糖凝膠 電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)基因玉米M0N810的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為266bp，轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的擴(kuò) 增產(chǎn)物大小為127bp。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR引物組合，所述引物組合的序列分別如Seq？ID？No.1-4所示。本發(fā)明還基于所述引物組合建立了檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR方法，可實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因作物樣品的定性檢測。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的檢測方法特異性好、通量高、快速，提高了檢測效率，為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604和MON810的檢測提供了更有效的方法。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105112409
【申請?zhí)枴緾N201510509662
【發(fā)明人】付偉, 魏霜, 杜智欣, 王晨光, 乾義柯, 張娜, 劉中勇, 朱水芳
【申請人】中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月18日