控制香雪蘭花色苷合成的查爾酮異構酶的cDNA的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬植物分子生物技術領域，具體涉及從紅花香雪蘭花瓣分離三條編碼查爾酮異構酶(FhCHI)的cDNA。
【背景技術】
[0002]查爾酮異構酶(Chalcone Isomerase, CHI)是類黃酮合成途徑早期階段的關鍵酶之一，是植物花色素苷生物合成所必需的酶，在CHI催化下，柚皮素查爾酮形成黃烷酮，黃烷酮再在其它酶的催化下轉化為各種顏色類型的類黃酮化合物，從而形成不同花色。
[0003]進化分析顯示CHI是由脂肪酸結合蛋白進化而來的立體專一性酶。CHI超家族包含四種類型蛋白。I型普遍存在于維管植物中，負責類黃酮的合成；II型是在豆科中參與異黃酮合成；111型是廣泛存在于陸生植物中的脂肪酸結合蛋白；IV型蛋白功能未知。CHI催化分子內的環(huán)化反應，I型CHI利用柚皮素查爾酮(6’ -羥基查爾酮)為底物，使雙環(huán)的查爾酮轉變?yōu)榫呱锘钚缘娜h(huán)(2S)-黃烷酮。
[0004]CHI有高度保守的結構域和活性位點氨基酸，但是他們在不同植物中也有差異。在豆科植物苜蓿中，CHI三維結構的分析表明有2組氫鍵起著主要的催化作用，第I組是保守的Thr48和Tyrl06與2個水分子之間的氫鍵，第2組是Asnll3和Thrl90與黃酮的7-羥基之間的氫鍵。對比分析這4個關鍵的氨基酸位點，發(fā)現(xiàn)它們在分支I和II中都是高度保守的。
[0005]CHI基因首先從法國豌豆中分離出來，目前已從沙梨、草莓、百脈根等上百種植物中克隆了 CHI基因，研究表明..CHI基因表達量的改變可導致類黃酮化合物合成的變化，已在煙草、大麻、馬鈴薯、番茄等植物中進行了轉基因驗證，改變了類黃酮化合物的含量。目前關于查爾酮異構酶的研究多集中在雙子葉植物，單子葉植物當中缺鮮有報道，尤其是單子葉園藝花卉植物香雪蘭未見報道。
[0006]

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明首次從紅花香雪蘭花瓣中克隆得到3條查爾酮異構酶(CHI)的cDNA，并確定了它的核苷酸序列和由此得出氨基酸序列。在香雪蘭花朵著色過程中，三者基因表達和花色苷合成呈現(xiàn)明顯的相關性，另外，將3個的真核表達載體轉染到擬南芥CHI突變體中，其幼苗和種皮都恢復了表型。
[0008]所以，本發(fā)明的目的是提供具有功能的編碼查爾酮異構酶(CHI)的新cDNA和由此推斷的氨基酸序列。
[0009]本發(fā)明的技術方案:
為了從首次從香雪蘭中克隆得到因，本發(fā)明人首先對紅花香雪蘭花瓣進行了轉錄組測序，拼接得到了 EST序列數(shù)據(jù)庫，然后利用利用擬南芥查爾酮異構酶氨基酸序列進行本地tblastn檢索，在香雪蘭中得到了多條與擬南芥查爾酮異構酶基因高度同源的序列，通過同源比較和氨基酸保守性分析，確定了三條與花色苷合相關的序列，隨后利用RT-PCR技術擴增得到了全長的cDNA序列，并在此基礎上推測得到了其相關的氨基酸序列。3條序列分別被命名為FhCHim FhCHI5,納開放閱讀框架687bp，編碼228個氨基酸，蛋白質的分子量推測是24，417Da，等電點為9.23，與金花茶(nitidissima )的查爾酮異構酶(CHI)同源性最高，達88% ； /^^似開放閱讀框架長771bp，編256個氨基酸，蛋白質的分子量推測是27，439Da，等電點為5.03，與中國水仙(Narcissustazetta var.chinensis)的CHI同源性最高，達到88%;開放閱讀框架長834bp，編碼277個氨基酸，蛋白質的分子量推測是29，832Da，等電點為5.14，與中國水仙(Narcissustazetta var.chinensis)的CHI同源性最高，達81%。香雪蘭FhCHIs和苜蓿MsaCHIl相比較，有很多保守的氨基酸是一致的，根據(jù)文獻報道，它們都具有4個高度保守的活性位點氨基酸精氨酸(Arg36)、蘇氨酸(Thr48)、酪氨酸(Tyrl06)、天冬酰胺(Asnll3)。
[0010]分別構建攜帶FhCHIl，F(xiàn)hCHim /?⑶/5的真核表達載體，轉入到農(nóng)桿菌GV3101細胞中，利用蘸花法侵染擬南芥突變體。結果表明:3條香雪蘭基因的導入都能夠使突變體的表型得到不同程度的恢復，高效液相(HPLC)分析結果表明:野生型擬南芥含有4個花色苷吸收峰，CHI突變體則沒有，而轉入基因的擬南芥也有4個吸收峰，只是含量少于野生型。初步證明我們克隆得到的3條查爾酮異構酶基因都具有查爾酮異構酶的功能。
[0011]利用半定量RT-PCR技術分析了三個查爾酮異構酶基因在開花過程中的表達模式，同時利用高效液相質譜串聯(lián)技術分析了香雪蘭開花過程中花色苷積累的規(guī)律，二者的相關性分析表明基因的表達與花色苷的積累正相關。
[0012]3條香雪蘭基因的cDNA的序列信息如下:
其中1:香雪蘭基因的全長cDNA序列(SEQ ID N0.1)
TCTAATGACAACAACAACGCTCCAGCCATCGGCTCTGGTCATAACCAAACTGGTGATCGCCGGCTTCCTCTTC
CCTCCGGCGATCACACCGCCGCCCGGCGATCAGCCCACACTATTCCTCGCCGGCGCAGGACAGAGGGGATTGGATGT
GGGGGGCAAACTCGTAATTTTTACGGCCATCGGCGTGTACCTGGAGGAGTCGGCGGTCCCGTCACTCGCCGGTAAAT
GGGAGGGGAAGGCGGCGGAGGAGCTCCTCGTGTCCGATCATTTCTTCCGGGATATCTACACCGGTCCATTTGAGAGG
CTCACAAAGGTGACCATGGTCTTGCCACTGACGGGCAAAGAGTACTCGGATAAGGTGTCCGAGAACTGTGTGGCCTA
CTGGAAGGCTGTCGGGACCTACGACAGAGCTAAACACGCGGCGATAGTGAAGCTAAAAGAGGTCTTTAAGTCCAAGA
CCTTTTCTCATGGCGCATCGATCCTCTTCACTCACGAATCTTCTGGCTCTTTGACTATTGGATTTTTGAAGAACAAC
TCGATGCCCGATTCTGGGGGCACAGTTATAAGGAGTAAAGCTCTGTCGGAGGCGATCTTGGAGTCTATCATTGGCAA
GAATGGAGTGTCGCCTGCAGCGAAAGAAAGTTTGGCGAGACGCATTTCAGCACTAATGAAGGAAAGGATCACGTCGT
MGAA
其中2..電FhCHIl基因核苷酸序列推測得到的蛋白質序列(SEQ ID N0.2)
MTTTTLQPSALVITKLVIAGFLFPPAITPPP⑶QPTLFLAGAGQRGLDVGGKLVIFTAIGVYLEESAVPSLAGKWEGKAAEELLVSDHFFRDIYTGPFERLTKVTMVLPLTGKEYSDKVSENCVAYWKAVGTYDRAKHAAIVKLKEVFKSKTFSHGASILFTHESSGSLTIGFLKNNSMPDSGGTVIRSKALSEAILESIIGKNGVSPAAKESLARRISALMKERITS-
其中3..FhCHI2基因的全長cDNA序列(SEQ ID N0.3)
CTGCAAATGCCACAAAAGTAAAGGCAAAGCCAACCAATCCTCACACTCTTTGTTATAACTCCCTCAACAACCAAACTCACAAGCATCACTAGTTTCTGATGACAATGGTGGAGATGGAAGTGTCACATTTGGTTTCAGCAACAACCACAA
AGCAAGAAATGCCTTTGGTTTCAGCAACAACCAAATTAGAAGTGGAAGGAGTTCTCTTCCAACCTCACCTCACACCA
TCTGGTTCTCCCCATAATCATTTTCTCGCCGGTGCCGGTGTGAGAGGATTGGAGATTGGTGGCAAGTTCATAAGCTT
TACCGCGATCGGCATCTACTTAGAAACTGAAGCAGCCGTCGAAGCCCTCGCTGTCAAATGGAAGGGCAAGACTGCCG
AGGAGCTTGCGGCATCTGCCGACTTCTTTCGAGATATCTACACAGGACCATTTGAGAAATTCACTAGAGTGACAATG
ATTCTCCCACTGACCGGCCAGCAGTACGCCGAGAAGGTGACCGAGAACTGCGTCGCTTACTGGAAGGCCATCGGTAA
ATATACAGACGCAGAAGCTGCAGCTGTCGACAAGTTCAGCGAAGTCTTCAAGCCGGAGATTTTCCCTCCTGGCTCCT
CCATCCTCTTCACTCATTCCCCATCTGGTTCGCTGACGATTGCCTTCTCCAAGGATGACTCCATTCCTGAAGCTGGC
ACTGCGATTATCGATAACGCAATGCTGACTGTGGCAATCTTGGAGTCGATCATCGGCGAACATGGCGTCTCTCCTGC
AGCGAAACAGAGCCTGGCGGTGCGACTGTCGAGCATGCTGAGTGAAGTCCAAGATGTGGAGAAATCTCAGGGCGAGA
AAACTGTGACTGTAATGTGTGCATGATATGGAGAGGCAGAGAGAAAAAGAAGCAGCCTTTGTAATCCTAAGGGTTCG
GATTATTAAAATAGGGAAATAAAAAGAGTTTGTAAGCATCTTGATTTCAAATATTATATATTGATTTTGTAATTTAA
GCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
其中\(zhòng) ?.電FhCHI2基因核苷酸序列推測得到的蛋白質序列(SEQ ID N0.4)MTMVEMEVSHLVSATTTKQEMPLVSATTKLEVEGVLFQPHLTPSGSPHNHFLAGAGVRGLEIGGKFISFTAIGIYLETEAAVEALAVKWKGKTAEELAASADFFRDIYTGPFEKFTRVTMILPLTGQQYAEKVTENCVAYWKAIGKYTDAEAAAVDKFSEVFKPEIFPPGSSILFTHSPSGSLTIAFSKDDSIPEAGTAIIDNAMLTVAILESIIGEHGVSPAAKQSLAVRLSSMLSEVQDVEKSQGEKTVTVMCA-
其中5:FhCHI5基因的cDNA全長核苷酸序列(SEQ ID N0.5)
CCCTTTCCTTATATATAGGCAAACGCAAAGTTCGACCGAGTCACTCTCTTTTTTGTTGCAACTCCCTTTCTGC
TCAAAATGGGCGAGGCATCACCTCTGGCTTCTGCAACAACCAAGCTGGAAGTGGAAGGAGTTGTCTTCCAACCTCAC
CTCACACCTCCTGGCTCTTCCAAGCCTCATTTCCTCGGCGGAGCCGGTGTGAGGGGATTGGAGATTGGTGGAAAGTT
CATAAGCTTCACAGCGATCGGCATTTACTTGGAGAGCGAGACGGCCGTTAAGGCCCTCGCTACCCAATGGAAGGGCA
AGGCTTCCGAGGAGCTGACATCCTGTGCGGACTTCTTTCGGGATATCTACACAGGACCATTTGAGAAGTTCACTAGA
GTGACAATGATCCTCCCGCTGACCGGCCAGCAGTACACCGAGAAGGTGACCGAGAACTGCGTTGCCTACTGGAAGGC
CATCGGTATCTATACCGACGCAGAAGCCGCAGCTGTAGACAAGTTCAAGGAAGTCTTCAAGTCAGAGAGCTTCGCTC
CTGGCTCCTCCATCCTCTTCAGTCACTCCCCATCTGGTTCGCTGACGATTGCATTCTCCAAGGATGAGTCCATTCCT
GAAGCCGGTACTGCAGTAATCGAGAATGCGGCACTGAGCTTGGCAATCTTGGAGTCTATTATTGGTGAGCATGGCGT
CTCTCCTATGGCGAAACAGAGCCTGGCACTGCGATTGTCGAGCATTATGCGTGAAGTTCATGATGTGGAGAAAGCCA
AGGGGGAGCAAACTGTATGTCAAGTCCAAGATGTGGAGAAAGCCGAGGGGAAGCAAACTGTGAGTGAAGTCCATGAT
GTGAAGAAAGACAAGAAAGTCGAGGGGGAGCAAACTGTGAGTACTGAAGTGCATGATGAGGAGAAATGATGCGGGGC
CACGAAGTTTGAGGG
其中&..電FhCHI5基因核苷酸序列推測得到的蛋白質序列(SEQ ID N0.6)MGEASPLASATTKLEVEGVVFQPHLTPPGSSKPHFLGGAGVRGLEIGGKFISFTAIGIYLESETAVKALATQffKGKASEELTSCADFFRDIYTGPFEKFTRVTMILPLTGQQYTEKVTENCVAYffKAIGIYTDAEAAAVDKFKEVFKSESFAPGSSILFSHSPSGSLTIAFSKDESIPEAGTAVIENAALSLAILESIIGEHGVSPMAKQSLALRLSSIMREVHDVEKAKGEQTVCQVQDVEKAEGKQTVSEVHDVKKDKKVEGEQTVSTEVHDEEK-
【附圖說明】
[0013]圖1..FhCHI1、FhCHI2、FhCHI5 基因的全長 RT-PCR 結果圖
圖2:同源性比對分析:香雪蘭FhCHIs和苜蓿MsaCHIl相比較，有很多保守的氨基酸是一致的，根據(jù)文獻報道，它們都具有4個高度保守的活性位點氨基酸精氨酸(R)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)，在圖中用紅框圈出。
圖3:擬南芥突變體表型恢復
野生型的幼苗和種皮顏色均呈現(xiàn)為紫色；《5突變體幼苗為綠色，種皮為黃色；而35S:: FhCHIl, 35S:: FhCHR和35S:: 轉入到擬南芥《狹變體后獲得的轉基因植株恢復了幼苗和種皮的紫色，證明這3條基因有查爾酮異構酶的功能。
[0014]圖4:轉基因植株花色苷檢測結果
其中A圖為野生型擬南芥，有4個吸收峰圖為《5突變體，沒有檢測到明顯的吸收峰；C圖、D圖、E圖分別為35S:..FhCHIUH: FhCHI2^\ 35S:: FhCHI5轉入《狹變體獲得的轉基因擬南芥，也有4個相應的吸收峰，只是峰面積小于野生型。進而證明35S: