具有黏附拮抗活性的擬態(tài)弧菌OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽、多肽組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽、多肽組合物及其應(yīng)用，尤其涉及具有黏附拮抗活性的擬態(tài)弧菌 OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽、多肽組合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 擬態(tài)弧菌（Vibriomimicus)是水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中常見的一種腸道病原菌，主要經(jīng)腸 黏膜感染引起魚類腹水病，嚴(yán)重威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。目前控制魚類腹水病的主要 手段是抗菌治療，但是隨著抗菌藥物的長期使用，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，不僅導(dǎo)致治療效果不明 顯，而且影響水產(chǎn)品質(zhì)量，還存在公共衛(wèi)生隱患。因此，亟需研發(fā)不產(chǎn)生耐藥性的新型抗擬 態(tài)弧菌感染的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了具有黏附拮抗活性的擬態(tài)弧菌OmpU 黏附素蛋白結(jié)合肽以及多肽組合物，并利用該結(jié)合肽和多肽組合物能與OmpU黏附素蛋白 發(fā)生特異性結(jié)合，從而有效地抑制擬態(tài)弧菌通過該黏附素黏附定植于腸黏膜表面，進而達 到消減擬態(tài)弧菌毒力的作用。
[0004] 為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案之一如下：
[0005] -種具有黏附拮抗活性的擬態(tài)弧菌OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽，本擬態(tài)弧菌OmpU黏 附素蛋白結(jié)合肽由下述氨基酸序列SEQIDNO: 1組成：
[0006] Asn-Cys-Thr-Asp-Lys-Leu-Cys-Leu-Leu-Pr〇-Pr〇-Val〇
[0007] 本發(fā)明還保護上述制備的具有黏附拮抗活性的擬態(tài)弧菌OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽 在制備擬態(tài)弧菌黏附拮抗劑中的應(yīng)用。
[0008] 進一步的，由具有黏附拮抗活性的擬態(tài)弧菌OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽制備的擬態(tài) 弧菌黏附拮抗劑應(yīng)用于拮抗擬態(tài)弧菌黏附，該鯉魚上皮瘤細(xì)胞即EPC細(xì)胞，是一種黏附模 式細(xì)胞。
[0009] 進一步的，由具有黏附拮抗活性的擬態(tài)弧菌OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽制備的擬態(tài) 弧菌黏附拮抗劑應(yīng)用于防治草魚腹水病。
[0010] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案之二如下：
[0011] -種具有黏附拮抗活性的擬態(tài)弧菌OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽的組合物，本組合物 由如下三種多肽組成：
[0012] 1)SEQIDN0:1
[0013] Asn-Cys-Thr-Asp-Lys-Leu-Cys-Leu-Leu-Pr〇-Pr〇-Val；
[0014] 2)SEQIDNO: 2
[0015] Thr-Trp-Thr-Cys-Ser-Asp-Val-Ile-Cys-Thr-Ala-Arg；
[0016] 3)SEQIDNO: 3
[0017] Ser-Cys-Thr-Ser-Pro-His-Cys-Phe-Met-Trp-Leu-Pro;
[0018] SEQIDNO: 1所示多肽、SEQIDNO:2所示多肽、SEQIDNO:3所示多肽三者的質(zhì) 量配比為1:1:1。
[0019] 本發(fā)明還保護上述制備的具有黏附拮抗活性的擬態(tài)弧菌OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽 的組合物在制備擬態(tài)弧菌黏附拮抗劑中的應(yīng)用。
[0020] 進一步的，由具有黏附拮抗活性的擬態(tài)弧菌OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽組合物制備 的擬態(tài)弧菌黏附拮抗劑應(yīng)用于拮抗擬態(tài)弧菌黏附鯉魚上皮瘤細(xì)胞。
[0021] 進一步的，由具有黏附拮抗活性的擬態(tài)弧菌OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽組合物制備 的擬態(tài)弧菌黏附拮抗劑應(yīng)用于防治草魚腹水病。
[0022] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果：
[0023] 1)、作為一種腸道病原菌，擬態(tài)弧菌通過黏附素黏附定植于腸黏膜表面是引發(fā)感 染的關(guān)鍵起始環(huán)節(jié)。外膜蛋白U(0utermembraneproteinU，OmpU)是擬態(tài)弧菌的重要黏 附素蛋白，也是抗擬態(tài)弧菌毒力的潛在藥物作用靶點。本發(fā)明提供了具有黏附拮抗活性的 OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽及其多肽組合物，此具有黏附拮抗活性的OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽 及其多肽組合物不但可與OmpU黏附素蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，而且能夠有效地抑制擬態(tài)弧 菌通過該黏附素黏附定植于腸黏膜表面，進而達到消減擬態(tài)弧菌毒力的作用。
[0024] 進而，由具有黏附拮抗活性的OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽及其多肽組合物制成的黏 附拮抗劑，能夠有效地防治擬態(tài)弧菌引起的魚類腹水病。
[0025] 2)、近年來，生物肽庫技術(shù)的建立與完善為研究生物活性肽提供了有效手段。噬菌 體隨機肽庫是將大量外源多肽基因與噬菌體衣殼蛋白pill融合表達并展示在噬菌體表面 形成的巨大隨機肽庫，被展示的多肽保持著相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。利用目標(biāo)靶 分子與展示多肽間的特異性親和力，即可將感興趣的蛋白或多肽從噬菌體隨機肽庫中篩選 出來，并且在得到目標(biāo)多肽氨基酸序列的同時獲得其編碼基因。與其他肽庫技術(shù)相比，噬菌 體隨機肽庫技術(shù)具有快捷、高通量、多肽表型與基因型一致等特點，已被廣泛應(yīng)用于抗原表 位分析、功能性短肽和肽類藥物篩選、蛋白質(zhì)互作位點分析等研究領(lǐng)域。
[0026] 本發(fā)明中提供了三種能與擬態(tài)弧菌OmpU黏附素蛋白特異性結(jié)合的多肽（均為 十二肽），三種多肽的氨基酸序列分別如序列表中的SEQIDN0:USEQIDN0:2和SEQIDN0:3所 示。采用的技術(shù)方案是選擇噬菌體隨機十二肽庫，以擬態(tài)弧菌OmpU黏附素蛋白為靶標(biāo)，通 過親和淘選方法從中篩選出3個與OmpU黏附素蛋白結(jié)合的陽性噬菌體克隆，經(jīng)間接ELISA 法和競爭抑制ELISA法確定該3個陽性噬菌體克隆表面展示的三種OmpU黏附素蛋白結(jié)合 肽均可與OmpU黏附素蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。
[0027] 本發(fā)明提供的三種OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽均具有黏附拮抗活性，能夠阻斷或抑 制OmpU黏附素蛋白黏附EPC細(xì)胞，也能抑制擬態(tài)弧菌黏附EPC細(xì)胞，三種多肽（SEQIDN0:1、 SEQIDN0:2和SEQIDN0:3)對擬態(tài)弧菌的平均黏附抑制率分別為92. 8± 1. 97 %、 83. 2 ±4. 03 %和74. 5 ±3. 25%。采用的技術(shù)方案是選擇EPC細(xì)胞作為細(xì)胞黏附模型，以兔 抗rOmpU純化抗體（本實驗室制備）為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔IgG(商品化購買）為二抗， 利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)證實SEQIDN0:1結(jié)合肽能夠阻斷OmpU黏附素蛋白與EPC細(xì)胞結(jié)合， SEQIDN0:2和SEQIDN0:3結(jié)合肽能夠明顯抑制OmpU黏附素蛋白與EPC細(xì)胞結(jié)合。同時通過 肽黏附抑制試驗證實三條結(jié)合肽能夠顯著抑制擬態(tài)弧菌對EPC細(xì)胞的黏附。
[0028] 本發(fā)明提供的三種OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽與OmpU黏附素蛋白的親和力強，通 過非競爭ELISA法（Beatty法）測得三種多肽（3￡〇10勵：1、3￡〇10勵:2和3￡〇10勵:3) 的親和常數(shù)分別為（1. 24±0. 56)X109L/moL(Pl)、（6. 17±0. 19)X10sL/moL(P2)和 (6. 15±0. 71)X10sL/moL(P3)。
[0029] 3)、本發(fā)明中的三種多肽（SEQIDN0:1、SEQIDN0:2和SEQIDN0:3)均可通過常規(guī)技 術(shù)如化學(xué)合成、基因克隆表達等方法制備。用醫(yī)藥領(lǐng)域常用的納微球材料（明膠、羥基磷灰 石、聚乳酸、殼聚糖、海藻酸等）包裹其中一種多肽或三種多肽即多肽組合物而制成的口服 黏附拮抗劑，均可用于由擬態(tài)弧菌感染引起的魚類腹水病的防治，因此本發(fā)明為魚類腹水 病的防治提供了新途徑，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0030] 圖1為間接ELISA初步鑒定與OmpU黏附素蛋白特異性結(jié)合的陽性噬菌體克隆。圖 1 中有 10 個克隆，分別命名為Pl、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9 和P10。
[0031] 圖2a、2b分別為競爭抑制ELISA進一步鑒定與OmpU黏附素蛋白特異性結(jié)合的陽 性噬菌體克隆。
[0032] 圖3為結(jié)合肽對OmpU黏附素蛋白黏附EPC細(xì)胞的拮抗作用。
[0033] 圖4為結(jié)合肽對擬態(tài)弧菌黏附EPC細(xì)胞的拮抗作用。
[0034] 圖5a、5b、5c分別為黏附拮抗肽Pl、P2、P3與OmpU黏附素蛋白的結(jié)合反應(yīng)曲線。
【具體實施方式】
[0035] 為了便于理解，以下將通過具體的實施例和附圖對本發(fā)明進行詳細(xì)地描述。需特 別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。
[0036] 下述說明中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；實驗方法中的所述試劑 和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0037] 下述說明中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0038] 下述說明中的比例，如無特別說明，均為體積比例。
[0039] 1.擬態(tài)弧菌OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽的親和淘選與鑒定
[0040] 1. 1親和淘選
[0041] 用包被液（pH8. 6,0?lmol/L的NaHC03溶液）分別將純化后的帶有His標(biāo)簽分子 的重組OmpU蛋白（即rOmpU蛋白）和His標(biāo)簽蛋白（均為本實驗室通過基因工程技術(shù)表 達和純化后獲得）稀釋為100yg/mL，包被酶標(biāo)板，每種蛋白重復(fù)4孔，100yL/孔，置4°C過 夜；次日棄包被液，每孔加200yL的5%BSA(牛血清白蛋白），37°C封閉lh;倒掉封閉液， 用TBST溶液（TBS+0. 5%Tween-20)洗滌6次。用TBST稀釋噬菌體隨機十二肽庫（購自美 國NEB公司）至1. 0X1013PFU/mL，取稀釋后的肽庫液100yL加到包被有His標(biāo)簽蛋白的 酶標(biāo)板孔內(nèi)，重復(fù)4孔，室溫振蕩60min，吸出孔內(nèi)未與His標(biāo)簽蛋白結(jié)合的噬菌體液體作為 預(yù)篩選液。用His標(biāo)簽蛋白預(yù)篩選的目的是排除rOmpU蛋白