中標(biāo)簽分子的干擾，提高篩選 的特異性。
[0042] 將100yL預(yù)篩選液加到包被有rOmpU蛋白的酶標(biāo)板孔內(nèi)，重復(fù)4孔，室溫振蕩 60min，棄孔內(nèi)液體，TBST洗滌6次。每孔加入100yL洗脫緩沖液（pH2. 2,0.2mol/L的甘 氨酸-HC1)，室溫振蕩lOmin，吸出洗脫液至離心管中，加入lmol/L的Tris-HCl(pH9. 1)中 和洗脫液。收集洗脫液，取2yL測定噬菌體滴度測定，其余的噬菌體侵染ER2738宿主菌， 擴(kuò)增并用PEG(聚乙二醇）提取噬菌體，用于下一輪親和淘選，共進(jìn)行四輪親和淘選。在四 輪親和淘選中，逐輪降低靶標(biāo)分子的濃度及其與肽庫作用時間，增加洗滌液中Tween-20濃 度和洗滌次數(shù)，以便得到親和力高、特異性強(qiáng)的噬菌體克隆。結(jié)果經(jīng)四輪篩選后，噬菌體的 回收率逐步上升，特異性噬菌體克隆得到較高程度的富集，最后一輪噬菌體富集倍數(shù)高達(dá) 1538 倍。
[0043] 1. 2與OmpU黏附素蛋白特異性結(jié)合的陽性噬菌體克隆鑒定
[0044] 為了獲得能與OmpU黏附素蛋白特異性結(jié)合的陽性噬菌體克隆，隨機(jī)挑取20個噬 菌體單克隆進(jìn)行間接ELISA法初步鑒定。即用濃度為100yg/mL的rOmpU蛋白包被酶標(biāo) 板，100yL/孔，4°C過夜。次日棄包被液，每孔加入200yL的5%BSA，37°C封閉lh;倒掉封 閉液，用TBST溶液洗滌6次。加入待檢噬菌體克隆，10SPFU/孔，每個克隆做3個重復(fù)，37°C 作用2h，實驗中設(shè)置空白對照（用PBS代替待檢噬菌體克?。┖完幮詫φ眨釉膸熘械?M13噬菌體）。TBST洗滌6次，加入1:5000HRP標(biāo)記鼠抗-M13抗體，200yL/孔，37°C作用 lh。此后按洗滌、顯色、終止、測定0D492nni的常規(guī)方法操作。結(jié)果如圖1所示，檢測的20個 噬菌體克隆中有1〇個克?。ǚ謩e命名為？1、？2、？3、？4、？5、？6、？7、？8、？9和？10克隆）的 平均〇D492nni值大于陰性對照平均〇D492nni值的2. 1倍，初步確定為陽性噬菌體克隆。
[0045] 采用競爭抑制ELISA法對上述10個初篩陽性噬菌體克隆進(jìn)一步鑒定。分別用濃 度為25yg/mL的rOmpU蛋白及His標(biāo)簽蛋白（以排除His標(biāo)簽蛋白的影響）包被酶標(biāo)板， 100yL/孔，每個待鑒定克隆包被一排酶標(biāo)孔，4°C過夜。次日棄包被液，封閉、洗滌同上。分 別將不同濃度（即濃度分別為 6. 25yg/mL、12. 5yg/mL、25yg/mL、50yg/mL、100yg/mL、 200yg/mL)的競爭物（包括rOmpU蛋白及His標(biāo)簽蛋白）分別與上述10個初篩陽性噬菌 體克隆等體積混合，37°C作用10min，取混合液分別加到相應(yīng)的已包被rOmpU蛋白或His標(biāo) 簽蛋白的酶標(biāo)孔中，100yL/孔，37°C作用lh，TBST洗滌6次，余下步驟同上。試驗中同時做 未加競爭物的初篩陽性噬菌體克隆對照（即用PBS代替競爭物與噬菌體克隆等體積混合）。
[0046] 根據(jù)公式計算抑制率，計算公式為：抑制率（％ )=(未抑制0D492nni值一抑制后 〇D492nni值）/未抑制〇D492nni值X100%。結(jié)果如圖2所示，隨著游離rOmpU競爭蛋白濃度的 增加，其對PI、P2和P3三個噬菌體克隆的競爭抑制率逐漸增加，當(dāng)游離rOmpU競爭蛋白的 濃度為200yg/mL時，對3個噬菌體克隆的競爭抑制率分別為70. 0%、68. 8%和65. 8%，均 大于50%，而相同濃度的游離His標(biāo)簽蛋白競爭物對上述3個噬菌體克隆的抑制率均低于 20%，從而排除了標(biāo)簽蛋白的干擾。結(jié)果表明游離rOmpU蛋白能抑制P1、P2和P3三個噬菌 體克隆與固相包被的rOmpU蛋白結(jié)合。說明這三個噬菌體克隆為陽性噬菌體克隆。
[0047] 1. 3陽性噬菌體克隆表面展示的OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽的序列測定
[0048] 使用噬菌體DNA單鏈提取試劑盒（購自美國Omega公司）提取陽性噬菌體克隆的 單鏈DNA，具體操作按照說明書進(jìn)行。提取的單鏈DNA樣品委托上海生物工程技術(shù)有限公司 測序。對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，獲得陽性噬菌體克隆表面展示的與OmpU黏附素蛋白特異 性結(jié)合的多肽（均為十二肽），其氨基酸序列（SEQIDN0:1、SEQIDN0:2和SEQIDN0:3)如表1 所示。
[0049] 表1OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽的氨基酸序列
[0050]
[0051] 結(jié)論：利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫篩選到3條能與OmpU黏附素蛋白特異性結(jié)合的多 肽。
[0052] 2.具有黏附拮抗活性的OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽的確定
[0053] 由于噬菌體表面展示多肽與OmpU黏附素蛋白的結(jié)合位點不一定恰是該蛋白的黏 附功能域，故通過噬菌體隨機(jī)十二肽庫技術(shù)篩選出來的3條OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽不一定 具有黏附拮抗活性。對此，本發(fā)明又進(jìn)一步確定具有黏附拮抗活性的OmpU黏附素蛋白結(jié)合 肽。
[0054] 2. 1OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽的合成
[0055] 委托上海淘普技術(shù)有限公司采用固相合成法合成上述3條OmpU黏附素蛋白結(jié)合 肽和1條OmpU蛋白信號肽（作為無關(guān)對照肽，其系列為ALAVSAAAVATG)，要求合成肽的純度 大于98%。
[0056] 2. 2結(jié)合肽對OmpU黏附素蛋白黏附細(xì)胞的拮抗作用檢測
[0057] 以鯉魚上皮瘤細(xì)胞（EPC)為細(xì)胞黏附模型，采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)合肽是 否具有拮抗OmpU蛋白黏附細(xì)胞的作用。用預(yù)先放有細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞板培養(yǎng)EPC細(xì) 胞，待細(xì)胞貼壁并形成單層后棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，依次加入4%多聚甲醛固定15min、 1%TritionX-100作用15min(目的是增加細(xì)胞壁通透性）和2%BSA封閉lh，各步驟之間 均用PBS漂洗3次。爾后，將濃度均為lmg/mL的3條OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽和1條無關(guān) 對照肽分別與相同濃度的rOmpU蛋白等體積（各150yL)混合，37°C孵育lh后加入細(xì)胞 孔，300yL/孔，每一樣品重復(fù)3孔，細(xì)胞板于28°C孵育lh，PBS漂洗3次，加入1:200稀釋 的兔抗rOmpU純化抗體（本實驗室制備），28°C孵育lh，漂洗后，再加入1:100稀釋的FITC 標(biāo)記羊抗兔IgG，28°C避光孵育lh，洗滌后，每孔加入50yL細(xì)胞核染色液（DAPI)，避光染 色10min，漂洗、干燥后，倒置熒光顯微鏡觀察rOmpU蛋白與EPC細(xì)胞結(jié)合狀況，試驗中同時 做rOmpU蛋白黏附對照組和細(xì)胞對照組。結(jié)果如圖3所示，細(xì)胞對照組的EPC細(xì)胞表面未 見到綠色熒光，僅細(xì)胞核被染成藍(lán)色；rOmpU蛋白黏附對照組EPC細(xì)胞以及經(jīng)無關(guān)對照肽與 rOmpU蛋白混合液共孵育的EPC細(xì)胞表面均出現(xiàn)明顯的綠色熒光，細(xì)胞核被染成藍(lán)色；經(jīng)結(jié) 合肽P1和rOmpU蛋白混合液共孵育的EPC細(xì)胞表面無綠色熒光，僅細(xì)胞核被染成藍(lán)色；經(jīng) 結(jié)合肽P2或P3與rOmpU蛋白混合液共孵育的EPC細(xì)胞表面有很少量的綠色熒光，細(xì)胞核 被染成藍(lán)色。表明表1中的結(jié)合肽P1能夠完全阻斷rOmpU蛋白與EPC細(xì)胞的特異性結(jié)合， 結(jié)合肽P2和P3能夠明顯抑制rOmpU蛋白與EPC細(xì)胞的特異性結(jié)合。
[0058] 2. 3結(jié)合肽對擬態(tài)弧菌黏附細(xì)胞的拮抗作用檢測
[0059] 以EPC為細(xì)胞黏附模型，采用肽黏附抑制試驗檢測結(jié)合肽是否具有抑制擬態(tài)弧 菌黏附細(xì)胞的作用。將濃度均為lmg/mL的3條結(jié)合肽及1條無關(guān)對照肽分別與濃度為 2X107CFU/mL的擬態(tài)弧菌04-14分離株菌懸液等體積混合，37°C輕搖孵育60min，將混合液 加到EPC單層細(xì)胞中，500yL/孔，重復(fù)3孔，28°C孵育60min，漂洗后，甲醇/冰乙酸固定細(xì) 胞，結(jié)晶紫染色，油鏡下隨機(jī)選擇30個細(xì)胞，計數(shù)細(xì)菌黏附數(shù)量，計算平均每個細(xì)胞表面或 四周的黏附菌數(shù)，試驗中同時做細(xì)胞對照和細(xì)菌黏附對照。結(jié)果如圖4所示，細(xì)胞對照組的 EPC細(xì)胞形態(tài)完好，無細(xì)菌黏附；未經(jīng)預(yù)處理的擬態(tài)弧菌04-14分離株以及經(jīng)無關(guān)對照肽預(yù) 處理的04-14分離株均能以聚集性方式良好地黏附細(xì)胞周圍，每個細(xì)胞的平均黏附數(shù)分別 為20. 4± 1. 50和20. 0±0. 83 ;而經(jīng)結(jié)合肽P1、P2和P3預(yù)處理后的擬態(tài)弧菌04-14分離株 對EPC細(xì)胞的黏附力均顯著下降，每個細(xì)胞的平均黏附數(shù)分別為1. 7±0. 42、3. 4±0. 83和 5. 1±0. 67,平均黏附抑制率分別為 92. 8 ±1. 97%、83. 2 ±4. 03 % 和 74. 5 ±3. 25%。
[0060] 結(jié)論：通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)結(jié)合肽黏附抑制試驗確定表1中的PI、P2和P3三條 OmpU黏附素蛋白結(jié)合肽具有黏附拮抗活性，我們將此三條肽簡稱為黏附拮抗肽。
[0061] 3.黏附拮抗肽的親和常數(shù)測定
[0062] 黏附拮抗肽與黏附素蛋白間的親和力越強(qiáng)，其黏附拮抗活性越大，而親和力的強(qiáng) 弱是由親和常數(shù)K值的大小來決定的。因此，本發(fā)明采用非競爭ELISA法（又稱Beatty法） 測定表1中的PI、P2和P3三條黏附拮抗肽的親和常數(shù)。
[0063] 3. 1黏附拮抗肽與rOmpU黏附素蛋白的結(jié)合反應(yīng)曲線繪制
[0064] 將3條黏附詰抗肽稀釋為20yg/mL、10yg/mL、5yg/mL和2. 5yg/mL4個濃度， 并橫向包被酶標(biāo)板，100yL/孔，4°C過夜。次日棄包被液，每孔加入200yL5%BSA，37°C封 閉2h;倒掉封閉液，用TBST液洗滌6次。將rOmpU純化蛋白稀釋為51. 2yg/mL、12. 8yg/ mL、3. 2yg/mL、0. 8yg/mL和0. 2yg/mL5個濃度，并縱行加至酶標(biāo)孔，100yL/孔，37°C作 用2h，TBST液洗滌6次。此后，依次加入兔抗rOmpU蛋白抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、 底物液、終