一種擴(kuò)增魚類基因組dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增魚類基因組DNA的方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 具有足量的高質(zhì)量基因組DNA (genomic DNA, gDNA)是進(jìn)行遺傳研究，如疾病診斷、 基因分析等的基礎(chǔ)。
[0003] 但在實(shí)際操作中，常因?yàn)榭捎玫膅DNA數(shù)量微少或質(zhì)量不佳而成為研究分析的限 制性因素；這種狀況在疾病診斷、腫瘤分子病理研究、法醫(yī)遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域表現(xiàn)得尤為突 出。而從血液、毛發(fā)等痕量組織或培養(yǎng)的細(xì)胞系中獲取gDNA費(fèi)用較高、耗時(shí)較長。解決這些 問題的途徑是對gDNA進(jìn)行高質(zhì)量的擴(kuò)增，增加可利用的gDNA的數(shù)量。目前，已報(bào)道的gDNA 擴(kuò)增方法主要包括兼并寡核苷酸引物PCR法（D0P-PCR)、擴(kuò)增前引物延伸法（PEP)、連接反 應(yīng)介導(dǎo)的基因組擴(kuò)增法（LMP)和多重置換擴(kuò)增法（MDA)。它們的主要原理為PCR擴(kuò)增gDNA， 但均存在不同的優(yōu)缺點(diǎn)。D0P-PCR法操作簡單，但其擴(kuò)增產(chǎn)物量少，擴(kuò)增片段較小，且當(dāng)初始 模板量較少時(shí)擴(kuò)增不能覆蓋整個(gè)基因組；PEP法使用了高度隨機(jī)的引物，提高了gDNA擴(kuò)增 覆蓋率，對長期保存組織的擴(kuò)增效果較好，但其擴(kuò)增產(chǎn)量低，保真性差；MDA法擴(kuò)增產(chǎn)量大， 可覆蓋99. 98%的基因組序列，且保真性高，但其對初始模板質(zhì)量要求較高；LMP法不能等 量擴(kuò)增所有g(shù)DNA片段，且步驟較繁，擴(kuò)增產(chǎn)物中引入了其他序列，丟失了酶切位點(diǎn)序列。
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種擴(kuò)增魚類gDNA的方法，能克服現(xiàn)有技術(shù) 的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)魚類gDNA快速、高質(zhì)量的擴(kuò)增，本發(fā)明耗時(shí)短、費(fèi)用低，并且擴(kuò)增效率、擴(kuò)增質(zhì) 量較高，在保證可靠性的情況下，本方法更簡便、快捷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服【背景技術(shù)】中提到的問題，本發(fā)明提出一種擴(kuò)增魚類基因組DNA的方法， 首先提取魚類基因組DNA作為模板，然后使用限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，產(chǎn)生的酶切 DNA片段連接特定的寡核苷酸接頭，然后根據(jù)酶切位點(diǎn)序列與接頭序列設(shè)計(jì)特定引物，并采 用PCR法擴(kuò)增酶切片段，以此增加基因組DNA的數(shù)量。本發(fā)明能克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn) 魚類基因組DNA快速、高質(zhì)量的擴(kuò)增；本發(fā)明耗時(shí)短、費(fèi)用低，并且擴(kuò)增效率與擴(kuò)增質(zhì)量較 高，在保證可靠性的情況下，本方法更簡便、快捷。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提出如下技術(shù)方案：
[0007] 所述的擴(kuò)增魚類基因組DNA的方法按照以下步驟進(jìn)行：
[0008] 第一步、提取魚類樣品中的基因組DNA;
[0009] 第二步、使用限制性內(nèi)切酶酶切魚類的基因組DNA，限制性內(nèi)切酶為：TaqI;
[0010] 第三步、酶切DNA片段連接特定的寡核苷酸接頭，并根據(jù)酶切位點(diǎn)序列與接頭序 列設(shè)計(jì)特定引物；酶切位點(diǎn)序列為：5' -AGCT-3';寡核苷酸接頭為：adaptor-F:5' -GACG ATGAGTCCTGAG-3' ，adaptor-R:5' -CGCTCAGGACTCAT-3，；
[0011] 第四步、采用PCR法擴(kuò)增酶切片段，以此增加魚類的基因組DNA的數(shù)量；所述的 PCR 引物為：primer:5' -GATGAGTCCTGAGCGA-3'〇
[0012] 進(jìn)一步，第一步具體步驟如下：
[0013] ①取一尾魚類樣品置于滅菌離心管中，待酒精揮發(fā)完畢后，加入400-600 iiL STE 裂解液，8-10 y L濃度為20mg/mL的蛋白酶K，顛倒混勻，放置于55°C水浴或搖床上消化4h 以上；
[0014] ②消化至澄清后，向消化液中加入2-4yL濃度為4mg/mL的RNaseA，輕微顛倒混 勻，并放置于37°C水浴中消化0. 5-lh ;
[0015] ③加入等體積酚：氯仿1:1輕微顛倒混勻，12000rpm離心10-12min，小心打開離心 管并吸取上清液至另一個(gè)已滅菌離心管中；
[0016] ④加入2. 5倍體積的無水乙醇，輕柔顛倒，并置于4°C環(huán)境中30-35min，之后低溫 離心機(jī)中4°C下12000rpm離心10-12min，小心吸棄上清液保留沉淀；
[0017] ⑤加入200-300 y L濃度為75 %的乙醇洗滌沉淀，并于低溫離心機(jī)中4 °C下 12000rpm離心10-12min，離心完畢后用移液器吸干離心管中的酒精；
[0018] ⑥自然風(fēng)干10_15min，以無酒精掛壁為準(zhǔn)，最后加入20-50 y L TE溶液溶解基因 組DNA，保存?zhèn)溆谩?br>[0019] 進(jìn)一步，第二步具體步驟如下：反應(yīng)體系為15yL，包括200-250ng的50ng/yL樣 品魚基因組DNA，0.5yL濃度為10u/yL的TaqI限制性內(nèi)切酶，3yL lOXTaqIbuffer， 超純水6. 5 y L ;反應(yīng)于65°C酶切3h以上，80°C變性20-30min ;酶切產(chǎn)物用1. 2%的瓊脂糖 凝膠電泳檢測。
[0020] 進(jìn)一步，第三步具體步驟如下：使用T4連接酶將寡核苷酸接頭連接在步驟二產(chǎn)生 的酶切片段的兩端，具體步驟如下：連接反應(yīng)體系為10 y L，包括6 y L第二步中的酶切產(chǎn) 物，lyL濃度為 lU/yL 的 T4連接酶，lyL 10XT4 131^€6^0.51^濃度為50^111〇1/1的 Taq I接頭，超純水1. 5 y L ;反應(yīng)程序?yàn)?6°C孵浴10h，結(jié)束后4°C保存。
[0021] 進(jìn)一步，第四步具體步驟如下：采用PCR法擴(kuò)增基因組DNA，PCR反應(yīng)體系為 20 y L，包括第三步的1 y L連接產(chǎn)物，濃度為50 y mol/L的TaqIprimer 0. 15 y L，濃度為 5U/yL 的 Pfu DNA 聚合酶0.12yL，2yL 的 10XPCR Buffer，1.2yL濃度為 25nmol/yL 的MgCl2,0. 25 y L濃度為lOnmol/ y L的dNTP，加超純水至總體積20 y L ;PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C 5min，25 個(gè)循環(huán)包括 94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s，最后 72°C 10min。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：
[0023] (1)酶切時(shí)使用高頻限制性內(nèi)切酶，產(chǎn)生較小的酶切片段，擴(kuò)增時(shí)使用高保真的 Pfu DNA聚合酶，減小PCR過程中的擴(kuò)增錯(cuò)誤；
[0024] (2)在PCR擴(kuò)增未進(jìn)入平臺期即停止擴(kuò)增，減小PCR后期出現(xiàn)錯(cuò)配的可能；
[0025] (3)本發(fā)明建立的基因組擴(kuò)增方法可解決大規(guī)模微衛(wèi)星分子標(biāo)記分析時(shí)DNA模板 數(shù)量不足的問題，本發(fā)明與FIASCO法（Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing r印eats)采用相同的內(nèi)切酶，即能夠消除以擴(kuò)增的基因組DNA做模板時(shí)由于微衛(wèi)星位點(diǎn)被 內(nèi)切酶酶切而導(dǎo)致微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增失敗的情況。
【附圖說明】
[0026]圖1為技術(shù)方案步驟一中基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜；
[0027] 圖2為技術(shù)方案步驟二中酶切的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜；
[0028] 圖3為技術(shù)方案步驟四中擴(kuò)增的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜；
[0029] 圖4為稀釋5000倍的基因組DNA原液、稀釋1000倍的連接反應(yīng)產(chǎn)物以及稀釋50 倍的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星分子標(biāo)記，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；
[0030] 圖5為使用擴(kuò)增的鯽魚基因組DNA為模板，微衛(wèi)星分子標(biāo)記的PCR產(chǎn)物的聚丙烯 酰胺凝膠電泳圖；泳道1-48為48條鯽魚初孵仔魚的微衛(wèi)星分子標(biāo)記電泳圖譜，泳道早、J 分別鯽魚初孵仔魚的父本與母本。
[0031] 圖1中M泳道為DNAladder，1-10泳道為10個(gè)鯽魚初孵仔魚的基因組DNA;
[0032] 圖2中M泳道為DNA ladder，1-4泳道為4個(gè)鯽魚初孵仔魚基因組DNA酶切電泳 圖；
[0033] 圖3中M泳道為DNA ladder，1-4泳道為擴(kuò)增的4個(gè)鯽魚初孵仔魚基因組DNA的 電泳圖；
[0034] 圖 4 中 M 泳道為 DNA ladder，HLJYJ028(GenBank 登錄號 FJ827516)與 HLJYJ055(GenBank登錄號FJ827533)分別為鯽魚的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，A與D泳道為基因組 DNA稀釋5000倍做模板，B與E泳道為連接產(chǎn)物稀釋1000倍做模板，C與F泳道為基因組 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍做模板的微衛(wèi)星分子標(biāo)記PCR產(chǎn)物電泳圖；以稀釋5000倍的基因 組DNA原液、稀釋1000倍的連接產(chǎn)物作為模板時(shí)均無法擴(kuò)增微衛(wèi)星分子標(biāo)記，而以稀釋50 倍的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板時(shí)則能擴(kuò)增出目的條帶，說明基因組DNA擴(kuò)增成功（由 于酶切-連接反應(yīng)與本發(fā)明操作均使用了基因組DNA，它們分別稀釋1000倍與50倍可使其 中的基因組DNA濃度與稀釋5000倍的基因組DNA原液濃度一致，即含有等量的原始基因組 DNA)；
[0035] 圖5中泳道1-48為48條鯽魚初孵仔魚的微衛(wèi)星分子標(biāo)記電泳圖譜，泳道早、分 別鯽魚初孵仔魚的父本與母本。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例和附圖1-5,對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0037] 所述的擴(kuò)增魚類基因組DNA的方法按照以下步驟進(jìn)行：
[0038] 第一步具體步驟如下：
[0039] ①取一尾魚類樣品置于滅菌離心管中，待酒精揮發(fā)完畢后，加入400-600 iiL STE 裂解液，8-10 y L濃度為20mg/mL的蛋白酶K，顛倒混勻，放置于55°C水浴或搖床上消化4h 以上；
[0040] ②消化至澄清后，向消化液中加入2-4yL濃度為4mg/mL的RNaseA，輕微顛倒混 勻，并放置于37°C水浴中消化0. 5-lh ;
[0041] ③加入等體積酚：氯仿1:1輕微顛倒混勻，12000rpm離心10-12min，小心打開離心 管并吸取上清液至另一個(gè)已滅菌離心管中；
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