42] ④加入2. 5倍體積的無水乙醇，輕柔顛倒，并置于4°C環(huán)境中30-35min，之后低溫 離心機(jī)中4°C下12000rpm離心10-12min，小心吸棄上清液保留沉淀；
[0043] ⑤加入200-300 y L濃度為75 %的乙醇洗滌沉淀，并于低溫離心機(jī)中4 °C下 12000rpm離心10-12min，離心完畢后用移液器吸干離心管中的酒精；
[0044] ⑥自然風(fēng)干10_15min，以無酒精掛壁為準(zhǔn)，最后加入20-50 y L TE溶液溶解基因 組DNA，保存?zhèn)溆谩?br>[0045] 第二步具體步驟如下：反應(yīng)體系為15 y L，包括200-250ng的50ng/ y L樣品魚基 因組DNA，0.5yL濃度為10u/yL的Taq I限制性內(nèi)切酶，3yL lOXTaq I buffer，超純水 6. 5 y L ;反應(yīng)于65°C酶切3h以上，80°C變性20-30min ;酶切產(chǎn)物用1. 2%的瓊脂糖凝膠電 泳檢測。
[0046] 第三步具體步驟如下：使用T4連接酶將寡核苷酸接頭連接在步驟二產(chǎn)生的酶切 片段的兩端，具體步驟如下：連接反應(yīng)體系為l〇yL，包括6yL第二步中的酶切產(chǎn)物，lyL 濃度為 1U/ y L 的 T4 連接酶，1 y L 10 X T4 buffer，0? 5 y L 濃度為 50 y mol/L 的 Taq I 接 頭，超純水1. 5 y L ;反應(yīng)程序?yàn)?6°C孵浴10h，結(jié)束后4°C保存。
[0047] 第四步具體步驟如下：采用PCR法擴(kuò)增基因組DNA，PCR反應(yīng)體系為20 y L，包括第 三步的1 y L連接產(chǎn)物，濃度為50 y mol/L的Taq I primer 0. 15 y L，濃度為5U/ y L的Pfu DNA聚合酶0? 12yL，2yL的 10XPCR Buffer，l. 2yL濃度為 25nmol/yL的MgCl2,0. 25yL 濃度為lOnmol/ y L的dNTP，加超純水至總體積20 y L ;PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C 5min，25個(gè)循 環(huán)包括 94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s，最后 72°C 10min。
[0048] 實(shí)施例1
[0049] 所述的擴(kuò)增魚類基因組DNA的方法按照以下步驟進(jìn)行：
[0050] 第一步具體步驟如下：
[0051] ①取一尾魚類樣品置于滅菌離心管中，待酒精揮發(fā)完畢后，加入400yLSTE裂解 液，8yL濃度為20mg/mL的蛋白酶K，顛倒混勻，放置于55°C水浴或搖床上消化4h以上；
[0052] ②消化至澄清后，向消化液中加入2yL濃度為4mg/mL的RNaseA，輕微顛倒混勻， 并放置于37°C水浴中消化0. 5h ;
[0053] ③加入等體積酚：氯仿1:1輕微顛倒混勻，12000rpm離心10min，小心打開離心管 并吸取上清液至另一個(gè)已滅菌離心管中；
[0054] ④加入2. 5倍體積的無水乙醇，輕柔顛倒，并置于4°C環(huán)境中30min，之后低溫離心 機(jī)中4°C下12000rpm離心10min，小心吸棄上清液保留沉淀；
[0055] ⑤加入200yL濃度為75%的乙醇洗滌沉淀，并于低溫離心機(jī)中4°C下12000rpm 離心10min，離心完畢后用移液器吸干離心管中的酒精；
[0056] ⑥自然風(fēng)干10min，以無酒精掛壁為準(zhǔn)，最后加入20 y L TE溶液溶解基因組DNA， 保存?zhèn)溆谩?br>[0057] 第二步具體步驟如下：反應(yīng)體系為15yL，包括200ng的50ng/yL樣品魚基因 組DNA，0.5yL濃度為10u/yL的Taq I限制性內(nèi)切酶，3yL lOXTaq I buffer，超純水 6. 5 y L ;反應(yīng)于65°C酶切3h以上，80°C變性20min ;酶切產(chǎn)物用1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢 測。
[0058] 第三步具體步驟如下：使用T4連接酶將寡核苷酸接頭連接在步驟二產(chǎn)生的酶切 片段的兩端，具體步驟如下：連接反應(yīng)體系為l〇yL，包括6yL第二步中的酶切產(chǎn)物，lyL 濃度為 1U/ y L 的 T4 連接酶，1 y L 10 X T4 buffer，0? 5 y L 濃度為 50 y mol/L 的 Taq I 接 頭，超純水1. 5 y L ;反應(yīng)程序?yàn)?6°C孵浴10h，結(jié)束后4°C保存。
[0059] 第四步具體步驟如下：采用PCR法擴(kuò)增基因組DNA，PCR反應(yīng)體系為20 y L，包括第 三步的1 y L連接產(chǎn)物，濃度為50 y mol/L的Taq I primer 0. 15 y L，濃度為5U/ y L的Pfu DNA聚合酶0? 12yL，2yL的 10XPCR Buffer，l. 2yL濃度為 25nmol/yL的MgCl2,0. 25yL 濃度為lOnmol/ y L的dNTP，加超純水至總體積20 y L ;PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C 5min，25個(gè)循 環(huán)包括 94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s，最后 72°C 10min。
[0060] 實(shí)施例2
[0061] 所述的擴(kuò)增魚類基因組DNA的方法按照以下步驟進(jìn)行：
[0062] 第一步具體步驟如下：
[0063] ①取一尾魚類樣品置于滅菌離心管中，待酒精揮發(fā)完畢后，加入500 y L STE裂解 液，9 y L濃度為20mg/mL的蛋白酶K，顛倒混勻，放置于55°C水浴或搖床上消化4h以上；
[0064] ②消化至澄清后，向消化液中加入3 y L濃度為4mg/mL的RNaseA，輕微顛倒混勻， 并放置于37°C水浴中消化0. 75h ;
[0065] ③加入等體積酚：氯仿1:1輕微顛倒混勻，12000rpm離心1 lmin，小心打開離心管 并吸取上清液至另一個(gè)已滅菌離心管中；
[0066] ④加入2. 5倍體積的無水乙醇，輕柔顛倒，并置于4°C環(huán)境中33min，之后低溫離心 機(jī)中4°C下12000rpm離心llmin，小心吸棄上清液保留沉淀；
[0067] ?加入250 111濃度為75%的乙醇洗滌沉淀，并于低溫離心機(jī)中4°(：下12000印111 離心llmin，離心完畢后用移液器吸干離心管中的酒精；
[0068] ⑥自然風(fēng)干13min，以無酒精掛壁為準(zhǔn)，最后加入35 y L TE溶液溶解基因組DNA， 保存?zhèn)溆谩?br>[0069] 第二步具體步驟如下：反應(yīng)體系為15yL，包括225ng的50ng/yL樣品魚基因 組DNA，0.5yL濃度為10u/yL的Taq I限制性內(nèi)切酶，3yL lOXTaq I buffer，超純水 6. 5 y L ;反應(yīng)于65°C酶切3h以上，80°C變性25min ;酶切產(chǎn)物用1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢 測。
[0070] 第三步具體步驟如下：使用T4連接酶將寡核苷酸接頭連接在步驟二產(chǎn)生的酶切 片段的兩端，具體步驟如下：連接反應(yīng)體系為l〇yL，包括6yL第二步中的酶切產(chǎn)物，lyL 濃度為 1U/ y L 的 T4 連接酶，1 y L 10 X T4 buffer，0? 5 y L 濃度為 50 y mol/L 的 Taq I 接 頭，超純水1. 5 y L ;反應(yīng)程序?yàn)?6°C孵浴10h，結(jié)束后4°C保存。
[0071] 第四步具體步驟如下：采用PCR法擴(kuò)增基因組DNA，PCR反應(yīng)體系為20 y L，包括第 三步的1 y L連接產(chǎn)物，濃度為50 y mol/L的Taq I primer 0. 15 y L，濃度為5U/ y L的Pfu DNA聚合酶0? 12yL，2yL的 10XPCR Buffer，l. 2yL濃度為 25nmol/yL的MgCl2,0. 25yL 濃度為lOnmol/ y L的dNTP，加超純水至總體積20 y L ;PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C 5min，25個(gè)循 環(huán)包括 94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s，最后 72°C 10min。
[0072] 實(shí)施例3
[0073] 所述的擴(kuò)增魚類基因組DNA的方法按照以下步驟進(jìn)行：
[0074] 第一步具體步驟如下：
[0075] ①取一尾魚類樣品置于滅菌離心管中，待酒精揮發(fā)完畢后，加入600yLSTE裂解 液，10 y L濃度為20mg/mL的蛋白酶K，顛倒混勻，放置于55°C水浴或搖床上消化4h以上；
[0076] ②消化至澄清后，向消化液中加入4yL濃度為4mg/mL的RNaseA，輕微顛倒混勻， 并放置于37°C水浴中消化lh;
[0077] ③加入等體積酚：氯仿1:1輕微顛倒混勻，12000rpm離心12min，小心打開離心管 并吸取上清液至另一個(gè)已滅菌離心管中；
[0078] ④加入2. 5倍體積的無水乙醇，輕柔顛倒，并置于4°C環(huán)境中35min，之后低溫離心 機(jī)中4°C下12000rpm離心12min，小心吸棄上清液保留沉淀；
[0079] ?加入300 111濃度為75%的乙醇洗滌沉淀，并于低溫離心機(jī)中4°(：下12000印111 離心12min，離心完畢后用移液器吸干離心管中的酒精；
[0080] ⑥自然風(fēng)干15min，以無酒精掛壁為準(zhǔn)，最后加入50 y L TE溶液溶解基因組DNA， 保存?zhèn)溆谩?br>[0081] 第二步具體步驟如下：反應(yīng)體系為15yL，包括250ng的50ng/yL樣品魚基因 組DNA，0.5yL濃度為10u/yL的Taq I限制性內(nèi)切酶，3yL lOXTaq I buffer，超純水 6. 5 y L ;反應(yīng)于65°C酶切3h以上，80°C變性30min ;酶切產(chǎn)物用1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢 測。
[0082] 第三步具體步驟如下：使用T4連接酶將寡核苷酸接頭連接在步驟二產(chǎn)生的酶切 片段的兩端，具體步驟如下：連接反應(yīng)體系為l〇yL，包括6yL第二步中的酶切產(chǎn)物，lyL 濃度為 1U/ y L 的 T4 連接酶，1 y L 10 X T4 buffer，0? 5 y L 濃度為 50 y mol/L 的 Taq I 接 頭，超純水1. 5 y L ;反應(yīng)程序?yàn)?6°C孵浴10h，結(jié)束后4°C保存。
[0083] 第四步具體步驟如下：采用PCR法擴(kuò)增基因組DNA，PCR反應(yīng)體系為20 y L，包括第 三步的1 y L連接產(chǎn)物，濃度為50 y mol/L的Taq I primer