的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)含有與序列表中序列6具有98. 56%-致性 的核苷酸序列（如序列表中序列22所示）和序列表中序列3具有98. 08% -致性的核苷酸 序列（如序列表中序列23所示），判斷該樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒和越南 衛(wèi)星DNAP，該判斷結(jié)果與通過(guò)發(fā)病表征判斷的結(jié)果一致；
[0127] 樣品編號(hào)為11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)含有與序列表中序列6具有98. 14%-致性 的核苷酸序列（如序列表中序列24所示）和序列表中序列3具有99. 04% -致性的核苷酸 序列（如序列表中序列25所示），判斷該樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒和越南 衛(wèi)星DNAP，該判斷結(jié)果與通過(guò)發(fā)病表征判斷的結(jié)果一致；
[0128] 樣品編號(hào)為12的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只含有與序列表中序列3具有97. 80%-致性 的核苷酸序列（如序列表中序列26所示），判斷該樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病 毒，該判斷結(jié)果與通過(guò)發(fā)病表征判斷的結(jié)果一致。
[0129] 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)果表明，本發(fā)明提供的試劑盒A可準(zhǔn)確的檢測(cè)番茄黃化曲 葉病毒和/或越南衛(wèi)星DNA0。
[0130] 實(shí)施例4、實(shí)施例2的試劑盒的特異性
[0131] 以實(shí)施例2的制備的試劑盒A或試劑盒B或試劑盒C進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，具體步驟 如下：
[0132] 1、用DNA提取試劑盒提取待測(cè)病毒（番茄黃化曲葉病毒、越南衛(wèi)星DNAP、或中國(guó) 番木瓜曲葉病毒）的基因組DNA，基因組DNA的濃度均為140ng/yL。
[0133] 2、完成步驟1后，向試管中加入24yL反應(yīng)試劑（反應(yīng)試劑A、反應(yīng)試劑B或反應(yīng) 試劑C)和1yL待測(cè)病毒的基因組DNA得到反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒回收，進(jìn)行測(cè)序。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C3min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30 個(gè)循環(huán)：72°ClOmin。
[0134] 按照上述步驟將待測(cè)病毒的基因組DNA替換為滅菌超純水作為空白對(duì)照，其它步 驟均不變。
[0135] 3、結(jié)果判定：如果待測(cè)病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有DNA分子1，則待測(cè)病毒為候選 的番茄黃化曲葉病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有DNA分子2,則待測(cè)病毒為候選的越南衛(wèi)星 DNA0;如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中既不含有DNA分子1又不含有DNA分子2,則待測(cè)病毒為候選 的非番前黃化曲葉病毒和非越南衛(wèi)星DNA0。
[0136] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：（1)向反應(yīng)試劑A或反應(yīng)試劑B中加入番茄黃化曲葉病毒的基因 組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只含有DNA分子1。（2)向反應(yīng)試劑A或反應(yīng)試劑C中加入越南衛(wèi)星DNA 的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只含有DNA分子2。 (3)除上述⑴和⑵外，反應(yīng)試劑（反應(yīng)試劑A、反應(yīng)試劑B或反應(yīng)試劑C)中加入待測(cè)病 毒的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均沒(méi)有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的試劑盒 A能特異性的檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒和/或越南衛(wèi)星DNA0，試劑盒B能特異性的檢測(cè)番茄 黃化曲葉病毒，試劑盒C能特異性的檢測(cè)越南衛(wèi)星DNA0，同時(shí)試劑盒（試劑盒A、試劑盒B 或試劑盒C)均與其他病原微生物無(wú)交叉反應(yīng)，如中國(guó)番木瓜曲葉病毒。
[0137] 實(shí)施例5、實(shí)施例2的試劑盒的靈敏度
[0138] 一、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的獲得
[0139] 將序列表的序列7所示的雙鏈DNA分子與載體pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒 pMD18-TY(標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲）。將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲命名為DNA1。DNA1中DNA濃度為1yg/ml。
[0140] 將序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子與載體pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒 PMD18-0 (標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙）。將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙命名為DNA8。DNA8中DNA濃度為1yg/ml。
[0141] 二、試劑盒A的靈敏度
[0142] 將上述步驟一中DNA1與DNA8等體積混合，命名為DNAa，DNAa中DNA濃度為1yg/ ml〇
[0143] 1、用無(wú)菌超純水稀釋DNAa，得到DNAb、DNAc、DNAd、DNAe和DNAf。使用Beckman UV-800紫外分光光度計(jì)測(cè)定稀釋后各個(gè)梯度的DNA濃度，分別為Ing/mL、lpg/mL、 1*10 7yg/mL、1*10 8yg/mL和 1*10 9yg/mL。
[0144] 2、向試管中加入24yL反應(yīng)試劑A和1yL步驟1制備的DNAa得到反應(yīng)液，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a。反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C3min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30 個(gè)循環(huán)：72°ClOmin。
[0145] 按照上述方法，將DNAa分別替換為步驟1制備的DNAb、DNAc、DNAd、DNAe、DNAf和 滅菌超純水，其它步驟均不變，分別得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物b、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物c、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物d、 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物e、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物f?和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物g。
[0146] 3、將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0147] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3 (圖3中M為T(mén)rans2KplusDNAMarker，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a，2 為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物b，3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物c，4為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物d，5為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物e，6為PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物f，CK為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物g)。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的試劑盒A對(duì)等量混合的番茄 黃化曲葉病毒和越南衛(wèi)星DNAI3質(zhì)粒DNA的最小檢測(cè)限為Ing/mL。
[0148] 三、試劑盒B的靈敏度
[0149] 1、用無(wú)菌超純水稀釋DNA1，得到DM2、DM3、DNA4、DNA5 和DNA6。使用Beckman UV-800紫外分光光度計(jì)測(cè)定稀釋后各個(gè)梯度的DNA濃度，分別為Ing/mL、lpg/mL、 1*10 7yg/mL、1*10 8yg/mL和 1*10 9yg/mL。
[0150] 2、向試管中加入24yL反應(yīng)試劑B和1yL步驟1制備的DNA1得到反應(yīng)液，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 1。反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C3min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30 個(gè)循環(huán)：72°ClOmin。
[0151] 按照上述方法，將DNA1分別替換為DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6和滅菌超純水， 其它步驟均不變，分別得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 5、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7。
[0152] 3、將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均進(jìn)行0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0153] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1 (圖1中M為T(mén)rans2KplusDNAMarker，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1，2 為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2, 3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3,4為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4, 5為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5,6為PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物6,CK為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7)。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的試劑盒B對(duì)番茄黃化曲葉病 毒質(zhì)粒DNA的最小檢測(cè)限為Ing/mL。
[0154] 四、試劑盒C的靈敏度
[0155] 1、用無(wú)菌超純水稀釋DNA8,得到DNA9、DNA10、DNA11、DNA12 和DNA13。使用 BeckmanUV-800紫外分光光度計(jì)測(cè)定稀釋后各個(gè)梯度的DNA濃度，分別為Ing/mL、lpg/mL、 1*10 7yg/mL、1*10 8yg/mL和 1*10 9yg/mL。
[0156] 2、向試管中加入24yL反應(yīng)試劑C和1yL步驟1制備的DNA8得到反應(yīng)液，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 8。反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C3min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30 個(gè)循環(huán)：72°ClOmin。
[0157] 按照上述方法，將DNA8分別替換為DNA9、DNA10、DNA11、DNA12、DNA13和滅菌超純 水，其它步驟均不變，分別得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物9、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物11、PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物12、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物13和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物14。
[0158] 3、將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均進(jìn)行0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0159] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2 (圖2中M為T(mén)rans2KplusDNAMarker，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8, 2 為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物9,3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10,4為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物11，5為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物12,6為 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物13,CK為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物14)。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的試劑盒C對(duì)越南衛(wèi)星 DNA0質(zhì)粒DNA的最小檢測(cè)限為Ing/mL。
[0160] 實(shí)施例6、利用實(shí)施例2制備的試劑盒A檢測(cè)待測(cè)樣本
[0161] 1、待測(cè)樣本的準(zhǔn)備：
[0162] A、用牙簽接種法將番茄黃化曲葉病毒侵染性克隆接種健康番茄葉片，得到待測(cè)樣 本一。具體接種步驟如下：
[0163] (1)用番茄黃化曲葉病毒侵染性克隆和根癌農(nóng)桿菌EHA105制備含有病毒侵染性 克隆的農(nóng)桿菌（制備方法見(jiàn)文獻(xiàn)：王祥.北方部分省市番茄黃化曲葉病毒的檢測(cè)鑒定及辣 椒分離物侵染性克隆構(gòu)建[D]:山東農(nóng)業(yè)大學(xué).2013)。
[0164] (2)將含有病毒侵染性克隆的農(nóng)桿菌單克隆接種在5mLYEP液體培養(yǎng)基（含50mg/ L卡那霉素和50mg/L鏈霉素）中，28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)24- 4