細胞的不同位置或者相同類型但是大小不同的細胞，可以認為其細胞膜電學(xué)特性例如V-和Vniax是相同的。甚至對于一些不同類型的細胞，很多哺乳動物細胞可能具有相似的細胞膜電學(xué)特性，包括V-和V _，因為細胞膜本質(zhì)上是分布著不同蛋白質(zhì)的磷脂雙分子層。
[0053]如圖3所示，對三種獨立的游離細胞進行了分析，包括左邊較大的半徑為“R”的細胞、中間半徑為“r”的中等大小的細胞和右邊較小的細胞。三個細胞中心排成一條直線以便用圓形表示細胞實體或者跨膜電勢分布圖。通過調(diào)整電場強度使左邊大細胞在頂點上達到Vniax，在頂點的Vniax和外邊WV_之間用陰影表示電穿孔有效表面。當大細胞獲得最優(yōu)電穿孔時:
[0054]Vnax= 1.5.E0.R
[0055]推導(dǎo)出
[0056]E0=Vnax/(1.5*R)
[0057]中等大小的細胞(半徑KR)在頂點上的跨膜電勢較低。在頂點上的跨膜電勢Vtop可以推導(dǎo)得出
[0058]Vtop= 1.5.E0.r = Vnax.r/R
[0059]中等大小細胞的跨膜電勢大于￥_的有效表面可以通過其外沿角度Θ^來確定，滿足的公式是
[0060]Vnin= 1.5.E ο.r.cos Θ r= V top.cos Θ r= (V nax.r/R).cos Θ
[0061]推導(dǎo)出
[0062]cos Θ r= (V nin/Vnax).(R/r)
[0063]中等大小的細胞的有效電轉(zhuǎn)表面積比大細胞小，在頂點的Vtop和外邊界V_之間用陰影表示。當r/R = Vnin/Vnax0t, cos Θ r為1，有效表面減少至O。因此細胞獲得有效電穿孔的最小半徑是
[0064]r_= (V_/Vnax).R
[0065]右邊半徑小于r_的小細胞上的任意一點都不會達到V _，不存在有效電轉(zhuǎn)表面。
[0066]因此細胞體積大小是電穿孔的重要影響因素。較大的細胞不僅在頂點上有更高的跨膜電勢并且有更大的有效電轉(zhuǎn)表面。當使用更高的電場使得較小細胞的跨膜電勢達到乂_時，較大細胞可能無法存活。細胞大小不同這個難以避免的因素可以導(dǎo)致電穿孔中一部分細胞差異性。比如，細胞群體中95%的細胞其半徑變化為大約20%并呈正態(tài)高斯分布，V_/V_(也就是匕^?約等于90%，只有半徑差異為10%的細胞可以進行有效電穿孔。根據(jù)高斯分布，當群體內(nèi)的中等大小細胞被電穿孔時，此時可以達到理論上的最高效率大約為67.3%。在傳輸更大的分子，其￥_八_(例如，r_/R)大約為95%時，理論上最高電穿孔效率為37.6%。
[0067]細胞體積大小的問題也會延伸至不同種類的細胞。因為許多種類的哺乳動物細胞擁有近似的VnuJPVniax,體積較小的細胞需要更高的電流場使其達到V_，與此同時伴隨著更高電流帶來的毒性例如高溫、自由基、氣體和金屬離子可能在有效電穿孔前對細胞產(chǎn)生不可逆的破壞。細胞體積大小不能被輕易改變，所以一個可以適用于不同體積大小細胞的電穿孔技術(shù)會很有意義，但是目前還沒有這樣的技術(shù)。
[0068]以上對獨立的理想細胞進行的跨膜電勢分析對于理解細胞電穿孔打下了基礎(chǔ)。在電穿孔時，經(jīng)常希望能夠使用大量的數(shù)量級為16至10 7的細胞數(shù)量。這些細胞又被置于一個體積小的容器中，主要是因為兩點:i)可以使需要傳輸?shù)哪繕宋镔|(zhì)達到高濃度，?)更小的樣品體積需要較少的能量，因此脈沖發(fā)生器的制造更加容易。
[0069]在一個典型的電穿孔中，約17的細胞懸浮在0.2ml介質(zhì)中，每個細胞平均約占據(jù)20，000 μ m3的介質(zhì)體積。每個細胞約占據(jù)邊長為27 μ m的立方體的空間，尺度比一般哺乳動物細胞大得不多。所以一般在電穿孔時，細胞之間的距離與大多數(shù)哺乳動物細胞的直徑比較相似，也就是細胞之間的距離可能很近。
[0070]方程⑴只有在一個單獨的游離細胞置于原本均一的電場中是有效的。當少量細胞被置于原本均一的電場中并且細胞之間的距離遠大于細胞直徑時，方程(I)大致也可以應(yīng)用。當細胞被擁擠在一起進行電穿孔時，每個細胞周圍的電場被細胞自身和周圍細胞所改變。雖然細胞膜內(nèi)在特性VnuJPVniax仍然一樣，方程⑴不再能用于計算指定位置上的跨膜電勢。所以，電場分布圖變得復(fù)雜和難以預(yù)測。細胞隨機位置不同是構(gòu)成細胞電穿孔效率差異性的另一層原因，即使細胞體積大小完全相同也是這樣。
[0071]因此，為了對電場有更好的了解以幫助設(shè)計更優(yōu)化的電穿孔和電融合方法，這里提出了對復(fù)雜電場的一種分析。
[0072]圖4示出了相同大小細胞的三種代表性排列方式。第一種類型是不受周圍細胞影響的游離細胞(F)。第二種和第三種排列方式代表了兩種相鄰細胞排列的特殊方式。第一種特殊排列方式中，兩個或多個細胞沿著總電流方向緊密地縱向排列。這種排列方式用SI，S2和S3三個細胞來表示。第二種特殊排列方式中，細胞橫向緊密排列在與總電流方向基本垂直的橫截平面上。這種排列方式用E1，E2和E3三個細胞來表示。雖然很難推出這些細胞上的跨膜電勢的準確方程式，相關(guān)的定性分析足以幫助提出改進電穿孔的方法。
[0073]如圖4所示，SI, S2和S3三個細胞緊密排成一條直線，這三個細胞對電流的阻擋和分流作用并沒有比游離細胞F明顯加強。因此，只有SI和S3細胞頂部表面的跨膜電勢與游離細胞F的相近。不僅如此，只有在電流方向下游的SI細胞頂部表面(圖4中陰影部分)可以對帶有負電荷分子進行有效電穿孔。如果把電流方向反過來，S3細胞也可以像SI細胞一樣對帶有負電荷分子進行有效電穿孔。因為SI和S3細胞的屏蔽效應(yīng)，S2細胞的跨膜電勢較低。排列在前面的前導(dǎo)細胞對排列在后的細胞的電穿孔屏蔽作用在這里定義為縱向屏蔽效應(yīng)?？v向屏蔽效應(yīng)在細胞間距離增加或者當細胞排列偏離嚴格的縱向方向時變得不那么明顯。細胞的縱向排列由于產(chǎn)生很多被屏蔽的細胞從而降低電穿孔效率，因此構(gòu)成了電穿孔效率不理想的另一層原因。
[0074]相反，EU E2和E3細胞在一起產(chǎn)生對電流更大的阻擋和限制作用。因此，EU E2和E3細胞的跨膜電勢比細胞F更高，正如它們形成一個特大型細胞。這些橫向排列的細胞不再遵循跨膜電勢公式⑴。因為在細胞平面附近總電流較小，這些細胞頂點附近的跨膜電勢從頂點下降比游離細胞更緩慢。以定性的方式來描述，E1、E2和E3每一個細胞都比F細胞有更大的Vniax點和￥_點之間有效電穿孔表面從而可以提高電穿孔效果，盡管有效電穿孔表面的形狀可能會變得有些不規(guī)則。
[0075]盡管一個三維等高線圖可以將E1、E2和E3細胞的真實有效電穿孔表面更加精確地描繪出來，圖4中二維陰影圖足以大致示出其更大的有效表面。橫向排列的細胞增加了相互的電穿孔可行性這種現(xiàn)象被定義為橫向增強效應(yīng)。橫向增強效應(yīng)在細胞間距離增加或者當細胞偏離橫截平面排列時變得不那么明顯。總體來說，在所指示電流方向下這些細胞電穿孔可行性排列順序為:
[0076]E2，E1，E3>S1，F(xiàn)>S2, S3
[0077]—般在細胞懸浮液中進行的電穿孔，復(fù)雜的細胞間的電交互作用按照特性可以主要歸類為三種情形:縱向屏蔽、橫向增強和前兩者的混合作用?；旌献饔迷诩炔皇敲黠@縱向排列也不是明顯橫向排列的鄰近細胞間產(chǎn)生，并且混合作用的屏蔽和增強效益都更弱。定性分析中揭示了縱向屏蔽效應(yīng)對于實現(xiàn)高效率的電穿孔通常是不合需要的?？v向屏蔽效應(yīng)的影響在細胞懸浮液中是很難避免的。改變電流方向可以使縱向排列細胞的兩個頂端表面都得以呈現(xiàn)來增加電穿孔效率。橫向增強效應(yīng)有利于電穿孔并且尤其對需要破壞性高電場才能達到V_的小體積細胞有很大幫助。
[0078]基于這些認識，期望在電穿孔時可以消除或者減少縱向屏蔽效應(yīng)帶來的不利影響并且使橫向增強效應(yīng)最大化。
[0079]回到圖1A中，當細胞處于橫跨電流場方向的緊密的細胞單層11中時，縱向屏蔽效應(yīng)在幾何上消失，細胞間的橫向增強作用增強。
[0080]如圖1A所不，在樣品容器10中絕緣室體14、第一電極15a和第二電極15b封住了上層介質(zhì)13和下層介質(zhì)12使得樣品不會漏出。樣品容器10可以有不同的形狀，例如為圓柱形或者非圓柱形。
[0081]在樣品容器10中使用的絕緣室體14可以由絕緣材料例如塑料、橡膠、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酰亞胺、聚二甲硅氧烷、環(huán)烯烴共聚物、熱塑性聚酯彈性體、玻璃、石英和硅制成。絕緣室體14可以由一個或者多個絕緣材料制成使得它變得堅固并且可以與電極緊密配合。
[0082]第一電極15a和第二電極15b可以由導(dǎo)電性材料例如招、鐵、鋼、鎳、鈦、鋅、銅、錫、銀、石墨和合金制成。它們還可以由鍍金屬材料、表面修飾的金屬或者表面涂層或者混合導(dǎo)電性材料的絕緣體例如橡膠或者塑料制成。第一電極15a和第二電極15b可以被設(shè)計為透明以便對細胞進行顯微鏡觀察，材料可以使用例如銦錫氧化物、鋁摻雜氧化鋅和摻銻氧化錫這類物質(zhì)。第一電極和第二電極可以由不同的材料制成或者被制成不同形狀。
[0083]電極15a可以為上部電極，電極15b可以為下部電極。兩個電極15a和15b之間的距離最好超過Imm以便容易處理液體，同時小于50mm以避免消耗過多需被傳送的目標物質(zhì)。在一個實施例中，兩個電極15a和15b之間的距離范圍在Imm到30mm之間以便容易處理和節(jié)約所傳送的物質(zhì)。電極板15a和15b的形狀和大小可以根據(jù)樣品容器10的形狀和大小決定。通常情況下不需要使用貴金屬例如金或者鈾制造電極15a和15b。但是惰性貴金屬例如金和鉑可以在不考慮成本因素或者容器需要被重復(fù)使用時用來制造電極15a和15b。
[0084]脈沖發(fā)生器18產(chǎn)生的電脈沖用來進行生物細胞的電穿孔。脈沖發(fā)生器18可以產(chǎn)生一個或者多個不同的脈沖波形例如指數(shù)衰減波、方波或矩形波、高頻波和多種波形組合。電穿孔所需的脈沖波形可以根據(jù)細胞種類、容器種類或其他數(shù)據(jù)進行設(shè)置。因此脈沖發(fā)生器18可以設(shè)定程序來產(chǎn)生預(yù)設(shè)的脈沖波形進行電穿孔。本發(fā)明中，一個脈沖或者一個脈沖波形可以指一個單脈沖或者由多個脈沖或多種脈沖波形組成的組合脈沖。
[0085]緊密的細胞單層11可以在電極表面或者兩個電極之間的任何地方形成。為了形成一個不直接在電極上的細胞單層11，可以在兩個導(dǎo)電介質(zhì)層12和13之間形成一個界面可以讓細胞停留。這個界面又指的是導(dǎo)電介質(zhì)層的表面。包含一定數(shù)量細胞的細胞懸浮液被放置在下層介質(zhì)12的表面。細胞可以懸浮在用來形成上層介質(zhì)13的介質(zhì)或緩沖液或者其他合適的介質(zhì)或緩沖液來形成細胞懸浮液。這些細胞可以通過自然重力或者人工施加離心力沉降到下層介質(zhì)12和上層介質(zhì)13之間的界面上。脈沖發(fā)生器18通過第一電極15a和第二電極15b傳輸特定波形的電脈沖到細胞