。離心分離時(shí)間范圍從幾秒到幾分鐘。其他離心時(shí)間也可以使用。旋轉(zhuǎn)加速的過程可以設(shè)置得比較平緩，使容器內(nèi)細(xì)胞不會(huì)移動(dòng)到介質(zhì)界面一側(cè)。對于介質(zhì)界面豎直的固定角轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)動(dòng)應(yīng)該立即開始來使懸浮液中細(xì)胞不會(huì)沉淀到一邊導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。
[0138]如圖10所示，金屬件55和56可以連接至旋轉(zhuǎn)軸58上來提供電脈沖進(jìn)行對細(xì)胞單層11上的細(xì)胞進(jìn)行離心過程中的電穿孔。
[0139]細(xì)胞進(jìn)入單層11或者多層細(xì)胞的細(xì)胞沉淀后電脈沖可以進(jìn)行傳輸。當(dāng)使用離心機(jī)50時(shí)，電脈沖可以在離心的同時(shí)或之后進(jìn)行傳輸。離心后施以脈沖，普通實(shí)驗(yàn)室用不含轉(zhuǎn)子內(nèi)電線的離心機(jī)也可以使用，合適的適配器可以將電穿孔容器保持在轉(zhuǎn)子內(nèi)。但是樣品容器10需要非常小心地從離心機(jī)50中取出，以避免在電脈沖前破壞細(xì)胞單層11或者細(xì)胞沉淀。在另一方面，在離心過程中進(jìn)行電脈沖可能是更加可靠和有利的。
[0140]在傳輸一個(gè)電脈沖后，細(xì)胞可以從樣品容器10中移出，或者如果用于電穿孔的介質(zhì)也適合細(xì)胞生存的話細(xì)胞可以保留在容器10中。一個(gè)離心機(jī)和一個(gè)脈沖發(fā)生器可以結(jié)合在一個(gè)機(jī)器中，這樣機(jī)器可以易于攜帶并且方便控制。
[0141]對于位置固定的脈沖發(fā)生器54，炭刷或者電刷59a和59b可以被用來將脈沖發(fā)生器的電脈沖傳輸至離心機(jī)轉(zhuǎn)子內(nèi)的樣品中。另外，最后加到樣品上的電脈沖也可以由轉(zhuǎn)子內(nèi)電路54產(chǎn)生從而避免電刷59a和59b產(chǎn)生的信號(hào)噪聲。轉(zhuǎn)子內(nèi)電路54可以安裝在旋轉(zhuǎn)軸58附近以便其不用承受高離心力。當(dāng)使用轉(zhuǎn)子內(nèi)電路54時(shí)，電刷59a和59b可以用來接收電能和控制命令，但是它們不在最后的脈沖傳輸線路內(nèi)。無觸點(diǎn)的電功率傳輸可以通過使用磁性能量轉(zhuǎn)移的方式實(shí)現(xiàn)，這種方式可以避免電刷59a和59b產(chǎn)生的信號(hào)噪聲。當(dāng)使用轉(zhuǎn)子內(nèi)電路54時(shí)，可以使用無線電信號(hào)控制轉(zhuǎn)子內(nèi)脈沖。
[0142]圖1lA示出了與所披露實(shí)施例相一致的示例性容器60。如圖1lA所示，底部電極65裝在絕緣室體61內(nèi)。帶絕緣的金屬線67連接到底部電極65上。被開口的蓋體62包圍的頂部電極66可以閉合在主絕緣室體61上并且密封住兩層介質(zhì)12、13和細(xì)胞單層11。蓋體62可以通過連接體63連接在主絕緣室體上。槽64可以做在主絕緣室體中來容納多余的樣品。電脈沖通過電極66和67傳輸。這種結(jié)構(gòu)可以有利于防止樣品在離心過程中泄Mo
[0143]圖1lB示出了示例性容器60的一種另外形式。絕緣室體61可以更改為開口的底部并且被放置于增大的底部電極65內(nèi)，底部電極65既有結(jié)構(gòu)支撐也有電連接的作用。上部電極66裝配在絕緣室61內(nèi)并通過絕緣室體61實(shí)現(xiàn)與電極65之間電隔離。容器60的這種另外形式也可以有利于防止樣品在離心過程中泄露。
[0144]理論上，轉(zhuǎn)子內(nèi)平面的介質(zhì)界面會(huì)產(chǎn)生少許不均勻的離心力，因?yàn)樾D(zhuǎn)半徑有些不同。如果離心時(shí)間不是很長的話，這個(gè)因素不會(huì)造成很大影響。細(xì)胞分布基本均勻可以通過使用一個(gè)較長的旋轉(zhuǎn)臂長度、使用一個(gè)可以減少細(xì)胞側(cè)向移動(dòng)的介質(zhì)界面和允許細(xì)胞在離心之前先沉淀來實(shí)現(xiàn)。樣品容器中可以配有彎曲的電極。樣品容器中一個(gè)彎曲的介質(zhì)界面可能在各點(diǎn)上具有相同旋轉(zhuǎn)半徑。配有繞自身軸旋轉(zhuǎn)的全圓柱形介質(zhì)界面的容器能夠理想地在界面所有點(diǎn)上提供相等的旋轉(zhuǎn)半徑，并且可以使用任意加速方式而不用考慮細(xì)胞側(cè)向移動(dòng)問題。
[0145]圖12A示出了與所披露實(shí)施例相一致的示例性容器70。容器70采取環(huán)形結(jié)構(gòu)配有一個(gè)彎曲的絕緣室體和兩個(gè)環(huán)形彎曲的電極來形成內(nèi)部空間以容納電穿孔樣品細(xì)胞。一個(gè)細(xì)胞單層11可以被放置在電極75和76中間的圓柱形表面。圖12A是容器70垂直于它的中心軸的截面視圖。當(dāng)容器70在離心機(jī)內(nèi)沿著它的中心軸旋轉(zhuǎn)時(shí)，單層11上的細(xì)胞承受相等的向外的離心力。在離心過程中，單層11上的細(xì)胞在離心加速完成后形成一個(gè)單層并在支撐表面保持穩(wěn)定。圖12B是容器70中把環(huán)形切開的剖面。由絕緣室體71和兩個(gè)電極75、76形成容器70的主體。
[0146]細(xì)胞單層11可以在離心力下直接放置于外圈電極75的表面?；蛘?，導(dǎo)電介質(zhì)層12可以被用來防止細(xì)胞單層11直接接觸電極。細(xì)胞在離心前可以首先懸浮在介質(zhì)13中。離心機(jī)例如圖10所示配有合適的轉(zhuǎn)子內(nèi)電連接線的離心機(jī)50可以來在離心過程中完成電穿孔操作。電極75、76可以通過轉(zhuǎn)子內(nèi)電連接線和電刷連接在脈沖發(fā)生器上。配有包封的絕緣室體的容器70的環(huán)形區(qū)段也可以使用。另外，彎曲的電極和/或者彎曲的介質(zhì)表面可用于容器例如容器10、20、30、40或60。在本發(fā)明中，電極或者導(dǎo)電介質(zhì)層表面可以是平的或者不平的。
[0147]另外，本發(fā)明可以適用于細(xì)胞電融合。當(dāng)細(xì)胞電融合是電穿孔的目標(biāo)，有兩個(gè)細(xì)胞單層的含有大約兩層細(xì)胞的雙層結(jié)構(gòu)可以用在與用于電穿孔樣品容器類似的容器中，例如示例性樣品容器10、20、30、40、60或70。每一層包含一種類型的細(xì)胞是較好的選擇，但是混合兩種類型的細(xì)胞也是可取的，盡管融合效率可能較低。
[0148]細(xì)胞雙層可以利用沉降速度差異依次或者一起形成，例如一種類型的細(xì)胞可以首先沉降然后另一種細(xì)胞跟隨落下。配有網(wǎng)型電極的容器便于制作不同種類的細(xì)胞雙層。第一種細(xì)胞懸浮液加入容器中到達(dá)網(wǎng)型電極的位置，細(xì)胞被收集在下層介質(zhì)表面。然后第二種細(xì)胞懸浮液加入容器中并漫過網(wǎng)型電極，使得細(xì)胞可以均勻放置在第一個(gè)細(xì)胞單層頂部。另一種制造兩個(gè)按序細(xì)胞單層的方法是利用兩個(gè)在不同介質(zhì)里的細(xì)胞懸浮液，該介質(zhì)可以形成一個(gè)界面并且第二種細(xì)胞懸浮液可以在第一種細(xì)胞懸浮液已經(jīng)形成細(xì)胞單層后加入。
[0149]在合適的緩沖液中的細(xì)胞雙層可以通過合適的電脈沖進(jìn)行處理用來促進(jìn)細(xì)胞融合。電脈沖的傳輸可以在離心過程中進(jìn)行。由于在細(xì)胞電融合過程中不用進(jìn)行目標(biāo)物質(zhì)傳輸，節(jié)省試劑并不是實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。因此用于?xì)胞融合的樣品容器的兩個(gè)電極之間可以有更大的距離以便更容易地依次形成不同種類的細(xì)胞雙層。不僅如此，兩種類型的細(xì)胞單層可以通過重復(fù)進(jìn)行除去離心的介質(zhì)并加入更多細(xì)胞懸浮液的操作從而形成三層或三層以上的細(xì)胞交替層的疊層用于細(xì)胞電融合。
[0150]圖13示出了與所披露實(shí)施例相一致的示例性細(xì)胞單層電穿孔方法200。首先，細(xì)胞分散在懸浮液中(202)。對于附著性細(xì)胞，它們先脫離附著再分散在懸浮液中。如有需要細(xì)胞可以進(jìn)行清洗。還有，細(xì)胞濃度可以通過一種計(jì)數(shù)方式確定(204)。適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞被取用來形成一個(gè)細(xì)胞單層或者多個(gè)細(xì)胞單層。之后，將細(xì)胞懸浮液的體積調(diào)整到適合樣品容器(206)。需要被傳輸?shù)哪繕?biāo)物質(zhì)可以在將細(xì)胞懸浮液裝入樣品容器前加入懸浮液中。然后，細(xì)胞懸浮液裝入樣品容器中(208)。
[0151]將細(xì)胞懸浮液裝入樣品容器后，使細(xì)胞排列為一個(gè)細(xì)胞單層(210)。如果細(xì)胞單層用重力自然沉淀來形成，樣品容器需要放置于水平表面上一段時(shí)間。形成一個(gè)細(xì)胞單層的時(shí)間可以靠實(shí)驗(yàn)決定。例如細(xì)胞單層的形成可以通過顯微鏡來觀察。如果細(xì)胞單層通過離心形成，樣品容器可以放置于離心機(jī)內(nèi)。形成細(xì)胞單層后，細(xì)胞用一個(gè)電脈沖處理(212)。如果利用離心機(jī)形成細(xì)胞單層，電脈沖處理的時(shí)間可以是離心之后或者在離心過程中。在細(xì)胞電脈沖處理后，細(xì)胞從樣品容器中取出(214)。如果在離心過程中進(jìn)行電脈沖處理，取出細(xì)胞前需停止離心機(jī)。對于細(xì)胞電融合，可以增加一個(gè)制造細(xì)胞雙層的步驟，并且緩沖液和電脈沖可以不同于一般以傳輸物質(zhì)為目的時(shí)所用的緩沖液和電脈沖。
[0152]本發(fā)明也可以適用于在細(xì)胞懸浮液中的電穿孔。圖14A示出了與實(shí)施例相一致的可以用于細(xì)胞懸浮液中電穿孔操作的示例性樣品容器80。如圖14A所示，容器80包含一個(gè)筒式絕緣室體81、固定電極85、具有密封蓋功能的可移動(dòng)電極86、開口的絕緣蓋體82和一個(gè)剩余液容納槽84。
[0153]絕緣室體81的底部有一個(gè)開口槽用于固定電極85，位于絕緣室體81壁上的頂部槽用于容納可移動(dòng)電極86。電極85的直徑可以略微大于絕緣室體81的底部開口槽直徑，使得電極85由于絕緣室體81底部產(chǎn)生的張力而緊固在其中?；蛘唠姌O85可以通過膠粘接或者其他方式固定在絕緣室體81上用于密封容器底部。
[0154]可移動(dòng)電極86可以被嵌入在開口絕緣蓋體82中，所述蓋體82可通過柔性連接體83連接至主絕緣室體81。蓋體82可以牢固地放入主絕緣室體81壁上的頂部槽內(nèi)，這樣允許電極86蓋在主絕緣室體81的內(nèi)側(cè)邊沿上而將樣品密封。為了密封細(xì)胞懸浮液87時(shí)比較可靠不產(chǎn)生氣泡，加入的細(xì)胞懸浮液的體積可以稍微大于密封的容器的可容納體積，使得有少量的剩余液體滲出來保證一個(gè)完美的密封狀態(tài)。在閉合電極蓋86時(shí)，剩余溢出的液體可以流入制作在主絕緣室體81頂部壁上的剩余液容納槽84中。進(jìn)行電穿孔后，剩余液體中的細(xì)胞可以被丟棄因?yàn)樗鼈儧]有經(jīng)過電穿孔。雖然將樣品密封在容器內(nèi)避免產(chǎn)生氣泡是很好的做法，一些小的氣泡是可被接受的只要這些小的氣泡只占據(jù)電極表面很小一部分。
[0155]對縱向屏蔽效應(yīng)和橫向增強(qiáng)效應(yīng)的理解也可以幫助提高懸浮液中細(xì)胞的電穿孔效率。對于較大體積的細(xì)胞類型，它們需要較低的電場強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)有效電穿孔，由于相鄰細(xì)胞間電場相互作用導(dǎo)致的細(xì)胞的差異性可能對電穿孔效率有一些不利影響。但是對于更多常見的較小體積的細(xì)胞種類，它們需要較高的電場強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)有效電穿孔，由于相鄰細(xì)胞間電場相互作用導(dǎo)致的細(xì)胞的差異性相反可能對細(xì)胞電穿孔較為有利。
[0156]對于較小的細(xì)胞，在懸浮液中增加細(xì)胞濃度可以提高橫向增強(qiáng)效應(yīng)?？v向屏蔽效應(yīng)也可能同時(shí)增強(qiáng)。增強(qiáng)的縱向屏蔽效應(yīng)可能成為提高橫向增強(qiáng)效應(yīng)時(shí)可以接受的代價(jià)?？v向屏蔽效應(yīng)可能通過交流電脈沖方案從而減輕。
[0157]細(xì)胞總體積占細(xì)胞懸浮液體積的最佳百分比可能由于細(xì)胞種類不同而變化。細(xì)胞總體積百分比大約等于或大于5%可能適合于大多數(shù)種類的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量不夠時(shí)，可以使用單層細(xì)胞電穿孔法中類似使用的人造絕緣顆粒。
[0158]對于改進(jìn)的細(xì)胞懸浮液的電穿孔，可以使用示例性樣品容器80或者其他用于單層電穿孔法的樣品容器。用于細(xì)胞懸浮液電穿孔的容器80中電極85和86之間一般有較大距離使得較少的細(xì)胞在電極附近從而減少對細(xì)胞造成電化學(xué)毒性。電極85和86之間的較優(yōu)距離最好在3mm到10mm之間，進(jìn)一步優(yōu)選距離在5mm至50mm之間。
[0159]容器80可以為圓柱形狀。容器80橫截面直徑可以大于1mm。在特定實(shí)施例中，容器80橫截面的直徑范圍在Imm至20mm。其他范圍外的直徑也可以使用。容器80的外形也可以是除了圓柱形以外的其他形狀。
[0160]可移動(dòng)電極例如容器80中的電極86可以使用在絕緣室體兩端，尤其當(dāng)容器內(nèi)徑很小或者當(dāng)電極之間距離很遠(yuǎn)的時(shí)候。對于這樣一個(gè)容器80，可能不方便只用一個(gè)可移動(dòng)電極裝載樣品。由于靠近電極附近的細(xì)胞承受明顯的電化學(xué)毒性，可以在絕緣室體81上做一些標(biāo)記用來指示將要丟棄