Rna制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種以未分解的方式提取生物試樣中的RNA的方法，其使用含有堿金 屬鹽及表面活性劑的RNA提取試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著基因工程的發(fā)展，在病毒的檢測、細(xì)胞動態(tài)分析、體質(zhì)檢查、醫(yī)藥品的奏效檢 查等中利用基因檢查。作為這些基因檢查中的分析對象之一的RNA與DNA相比不穩(wěn)定，容 易因生物試樣中所含的內(nèi)源性核糖核酸酶及高溫?堿處理而分解。因此，在RNA的制備中 需要用于防止其分解的先進(jìn)技能、多階段的實(shí)驗(yàn)工序、昂貴的專用設(shè)備?試劑。
[0003] 例如，作為從生物試樣中回收RNA的一般方法，已知通過組合使用蛋白質(zhì)改性劑 和有機(jī)溶劑來溶解被分析物，使內(nèi)源性核糖核酸酶失活而回收未分解的RNA的異硫氰酸 胍-苯酚-氯仿（AGPC)法（非專利文獻(xiàn)1)及熱酚法（非專利文獻(xiàn)2)。但是，這些方法 均含有抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)等酶反應(yīng)的有機(jī)溶劑及高濃度的改性劑，因此，不僅危險性較高， 而且需要用于除去這些物質(zhì)的多階段的工序和較長的處理時間，從成本及簡便性的方面考 慮，存在問題。
[0004] 另一方面，出于使RNA的制備簡便的目的，也開發(fā)了一種在不使用有機(jī)溶劑的情 況下，使用強(qiáng)離液物質(zhì)和表面活性劑作為蛋白質(zhì)改性劑提取RNA，將提取液直接供與酶反應(yīng) 的方法。例如，已知使用硫氰酸胍和肌氨酰作為改性劑溶解生物試樣，一邊保護(hù)RNA不受內(nèi) 源性核糖核酸酶的影響而分解，一邊進(jìn)行提取的方法（專利文獻(xiàn)1)。該提取液可以直接供 與酶反應(yīng)。根據(jù)該方法，在將提取液供與酶反應(yīng)之前，不需要除去改性劑的工序，能夠比現(xiàn) 有方法更簡便地提取RNA。但是，硫氰酸胍等強(qiáng)離液物質(zhì)及肌氨酰為蛋白質(zhì)的強(qiáng)改性劑，從 有效的酶反應(yīng)這樣的觀點(diǎn)考慮，不優(yōu)選酶反應(yīng)體系中存在這些強(qiáng)改性劑。
[0005] 相對于此，作為不抑制之后的酶反應(yīng)的核酸提取法，已知使用了膽酸、乙醇酸的方 法（專利文獻(xiàn)2)。根據(jù)本方法，從生物試樣中所提取的核酸可以不需要純化工序及稀釋工 序直接供與核酸擴(kuò)增法等酶反應(yīng)。但是，本方法無法防止內(nèi)源性核糖核酸酶導(dǎo)致的RNA的 分解，無法提取未分解的RNA。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)1 :日本專利第4836795號公報
[0009] 專利文獻(xiàn)2 :國際公開第2007/116450號
[0010] 非專利文獻(xiàn)
[0011] 非專利文獻(xiàn) 1 :Chomczynski&Sacchi(1987)AnalyticalBiochemistry，162 : 156-159.
[0012] 非專利文獻(xiàn)2 :水野貴之（2003)生物實(shí)驗(yàn)說明（7)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 發(fā)明所要解決的課題
[0014] 本發(fā)明的目的在于，提供一種比現(xiàn)有方法更簡便地制備可供試于酶反應(yīng)的RNA的 方法。
[0015] 用于解決課題的技術(shù)方案
[0016] 本發(fā)明涉及一種用于提取生物試樣中的RNA的試劑，其含有堿金屬鹽及表面活性 劑。
[0017] 優(yōu)選堿金屬鹽為堿金屬鹵化物。
[0018] 優(yōu)選堿金屬鹽為氯化鋰。
[0019] 優(yōu)選表面活性劑含有乙醇酸類。
[0020] 優(yōu)選表面活性劑還含有脫氧膽酸類。
[0021] 另外，本發(fā)明涉及一種RNA提取試劑盒，其具有所述用于提取生物試樣中的RNA的 試劑。
[0022] 另外，本發(fā)明涉及一種提取生物試樣中的RNA的方法，該方法包括：使用所述用于 提取生物試樣中的RNA的試劑或RNA提取試劑盒。
[0023] 發(fā)明的效果
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，可在未分解狀態(tài)下比現(xiàn)有方法更簡便地制備可供與酶?化學(xué)反應(yīng)等 試驗(yàn)的RNA。
【附圖說明】
[0025] 圖1為示出了以細(xì)胞為被分析物提取RNA并供與RT-PCR的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面，對本發(fā)明詳細(xì)地進(jìn)行記載。
[0027] 在本發(fā)明中，為了從生物試樣制備未分解性RNA，使用堿金屬鹽和表面活性劑，在 防止RNA因被分析物內(nèi)存在的核糖核酸酶導(dǎo)致的分解的同時，制備可供試于之后的酶反應(yīng) 的RNA〇
[0028] 在本發(fā)明中，所謂生物試樣，可例示：動物或植物的細(xì)胞、組織、全血、血清、淋巴 液、組織液、尿、精液、陰道液、羊水、眼淚、唾液、汗等體液、源自于外來體等細(xì)胞的卵泡、糞 便、痰、細(xì)菌、病毒等，但只要為含有核酸的物質(zhì)即可，不限定于此。
[0029] 在本發(fā)明中，所謂RNA，可例示：信使RNA及轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、小核RNA、核仁小 分子RNA、微RNA等不可翻譯RNA等，但只要為含有核糖核苷酸的聚合物的物質(zhì)即可，不限定 于此。
[0030] 就RNA的一般制備方法、即利用RNA對固相載體的吸附的方法及利用有機(jī)溶劑及 水溶性高分子、表面活性劑的添加導(dǎo)致的RNA的不溶化的方法而言，不僅需要用于純化處 理液的復(fù)雜操作，而且根據(jù)RNA的分子量在回收效率上有差別，有時無法得到目標(biāo)RNA。另 一方面，本發(fā)明中的RNA制備方法可將RNA提取液直接供試于之后的分析，處理液具有無損 失地含有被分析物中所含的所有分子量的RNA這樣的優(yōu)點(diǎn)。
[0031 ] 在本發(fā)明中，用于提取RNA的RNA提取試劑含有堿金屬鹽作為RNA保護(hù)劑。
[0032] 所謂本發(fā)明中的堿金屬鹽，可例示：鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、銣鹽、銫鹽。可優(yōu)選例示：氯 化鋰、溴化鋰、碘化鋰、醋酸鋰、氫氧化鋰、氟化鈉、氯化鈉、溴化鈉、碘化鈉、醋酸鈉、焦磷酸 鈉、硫氰酸鈉、硫酸鈉、亞硫酸鈉、二亞硫酸鈉、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、酒石酸鈉、硝酸鈉、氟 化鉀、氯化鉀、溴化鉀、碘化鉀、醋酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鉀、氟化銣、氯化銣、溴化銣、碘化 銣、醋酸銣、氯化銫、溴化銫、碘化銫、醋酸銫，但不限定于此。可更優(yōu)選例示堿金屬鹵化物。 可進(jìn)一步優(yōu)選鹵化物中的離液效果較小的氯化鋰。這些堿金屬鹽可以單獨(dú)使用，也可以組 合使用。
[0033] 堿金屬鹽具有RNA保護(hù)效果，另一方面，不會成為核酸相關(guān)酶的輔因子，與其它產(chǎn) 生可成為輔因子的多價陽離子的金屬鹽相比，具有對酶活性造成的影響較小這樣的優(yōu)點(diǎn)。
[0034] RNA提取試劑中所含的堿金屬鹽的濃度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定最佳 值，但作為一個例子，優(yōu)選〇. 2M以上且飽和濃度以下，更優(yōu)選0. 3M以上且5. 0M以下，進(jìn)一 步優(yōu)選0. 3M以上且2. 5M以下。若堿金屬鹽的濃度過低，則無法保護(hù)RNA免受內(nèi)源性核糖 核酸酶導(dǎo)致的分解，若濃度過高，則可以保護(hù)RNA，但存在抑制之后的酶反應(yīng)的傾向。
[0035] 在本發(fā)明中，RNA提取試劑含有表面活性劑作為被分析物溶解劑。所謂本發(fā)明 中的表面活性劑，可例示離子型、非離子型、雙離子型表面活性劑?？蓛?yōu)選例示：Tween20、 Tween40、Tween60、Tween80等Tween類、TritonX-100、TritonX-114、TritonXL-80N等 Triton類、Nonidet類、NP-40等非離子型表面活性劑、膽酸類、脫氧膽酸類、乙醇酸類等陰 離子型表面活性劑，可更優(yōu)選例示：TWeen20、TritonX-100、脫氧膽酸、乙醇酸，但只要為不 抑制酶反應(yīng)的表面活性劑即可，不限定于此。這些表面活性劑可以單獨(dú)使用，也可以組合使 用。
[0036] RNA提取試劑中所含的表面活性劑的濃度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定最佳 值，但在使用膽酸類、脫氧膽酸類、乙醇酸類的情況下，其濃度優(yōu)選為ImM以上。若表面活性 劑的濃度過低，則存在無法使生物試樣溶解的傾向。
[0037] 在本發(fā)明中，RNA提取試劑可以含有緩沖劑。作為本發(fā)明中的緩沖劑，可優(yōu)選使 用磷酸緩沖液及兩性離子緩沖液等緩沖劑。其中，優(yōu)選MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、 M0PS0、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPS0、P0PS0、HEPPS0、EPPS、Tricine、Tris、Bicine、 TAPS、CHES、CAPS0、CAPS等兩性離子緩沖液，特別優(yōu)選TAPS。這些緩沖劑可以單獨(dú)使用，也 可以組合使用。
[0038] 在本發(fā)明中，RNA提取試劑可以含有具有源自于生物試樣的異物導(dǎo)致的酶反應(yīng)抑 制降低效果的白蛋白等蛋白質(zhì)成分、多胺、環(huán)糊精、海藻糖、PVP(聚乙烯吡咯烷酮）、聚乙二 醇等水溶性尚分子。
[0039] 在本發(fā)明中，RNA提取試劑可以含有用于防止在冰點(diǎn)下的凍結(jié)的甘油、甜菜堿、蔗 糖等防凍劑。
[0040] 在本發(fā)明中，RNA提取試劑可以含有用于確保核酸酶活性失活的螯合劑及核酸酶 抑制劑、DTT(二硫蘇糖醇）等還原劑、用于之后的酶反應(yīng)的DMS0及甲酰胺這樣的有機(jī)溶劑。
[0041] 生物試樣和RNA提取試劑的混合比優(yōu)選為9:1~1:999,更優(yōu)選為4:1~1:499， 進(jìn)一步優(yōu)選為1:1~1:99。
[0042] 在本發(fā)明中，將生物試樣和RNA提取試劑混合后，在RNA提取處理時，可以物理破 碎生物試樣，也可以與例如利用凍結(jié)融化的破碎及利用均質(zhì)器的物理破碎法等組合。另外， 根據(jù)本發(fā)明，在將生物試樣和RNA提取試劑混合之前，即使不進(jìn)行破碎操作也可提取RNA。
[0043] 將生物試樣和RNA提取試劑混合后，為了從生物試樣中提取RNA，可以實(shí)施熱處 理。熱處理溫度優(yōu)選為〇°C以上且100°C以下，更優(yōu)選為30°C以上且90°C以下，進(jìn)一步優(yōu)選 為50°C以上且80°C以下。若溫度過低，則存在提取效率降低的傾向，若過高，則存在RNA分 解的傾向。熱處理時間優(yōu)選為30分鐘以下，更優(yōu)選為15分鐘以下。若處理時間過短，則存 在提取效率降低的傾向，若過長，則存在RNA分解的傾向。
[0044] 在本發(fā)明中，對于RNA提取液，不需要進(jìn)一步的純化工序及稀釋工序等，可將RNA 提取液混入酶反應(yīng)溶液直接作為底物，引發(fā)核酸擴(kuò)增反應(yīng)等酶反應(yīng)。作為使其反應(yīng)的酶，例 如可以舉出：脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶等核酸酶、蛋白酶、肽 酶等蛋白酶、DNA依賴性DNA聚合酶、RNA依賴性DNA聚合酶、DNA依賴性RNA聚合酶、RNA 依賴性RNA聚合酶、耐熱性聚合酶、鏈置換聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶等聚合酶、連接酶、重組酶、 溶解酶、纖維素酶等。RNA提取液和酶反應(yīng)溶液的混合比優(yōu)選為1:999~999:1，更優(yōu)選為 1:99~99:1，進(jìn)一步優(yōu)選為1:49~49:1。
[0045] 在本發(fā)明中，RNA提取液可以與溴化乙錠、SYBR(R)Green、PicoGreen(R)等核酸熒 光標(biāo)記試劑及熒光標(biāo)記探針混合，對含有的RNA進(jìn)行檢測。另外，也可在熒光標(biāo)記試劑存在 下將RNA提取液供與核酸擴(kuò)增反應(yīng)，實(shí)時監(jiān)控擴(kuò)增反應(yīng)。另外，也可將RNA提取液供與測序 反應(yīng)。
[0046] 在本發(fā)明中，所謂核酸擴(kuò)增反應(yīng)，為PCR法所代表的使核酸序列擴(kuò)增的方法，例如 除PCR法以外，可例示：LCR(連接酶鏈反應(yīng)）法、SDA(鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)）法、RCA(滾環(huán)擴(kuò)增 反應(yīng)）法、CPT(循環(huán)探針技術(shù)）法、Q-P復(fù)制擴(kuò)增技術(shù)法、ICAN(恒溫和嵌合引物引發(fā)的核 酸擴(kuò)增反應(yīng)）法、LAMP(DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增）法、NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增方法）法 及TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)）法等公知的方法，但并不限定于這些方法。
[0047] 在本發(fā)明中，可將具有與RNA提取液中所含的部分目標(biāo)核酸互補(bǔ)的核酸的分子、 抗體或者單鏈核酸結(jié)合蛋白質(zhì)等具有特異性結(jié)合能力的分子及目標(biāo)核酸混合，使其特異性 結(jié)合。簡言之，可使用RNA提取液進(jìn)行Southern印跡、Northern印跡、實(shí)時PCR、利用標(biāo)記 核酸探針等的特異性核酸的標(biāo)記、檢測、純化、分離等。
[0048] 在本發(fā)明中，也可將RNA提取液供與離子交換柱、凝膠過