濾柱等各種色譜及離心、 過濾、透析、在固相載體上的吸附處理，分離異物，純化RNA提取液中所含的RNA。另外，也可 適宜組合這些技術(shù)方案用作RNA純化試劑盒。
[0049] 本發(fā)明的試劑盒具有上述RNA提取試劑。此外，例如可以具有被分析物清洗液、脫 氧核糖核酸酶、蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶及其底物、寡核苷酸。
[0050] 也可將本發(fā)明的試劑及試劑盒裝入核酸制備裝置、核酸擴(kuò)增裝置、核酸自動分析 裝置等中。
[0051] 實(shí)施例
[0052] 下面，通過實(shí)施例對本發(fā)明具體地進(jìn)行說明。但是，本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施 例。
[0053] [實(shí)施例1]
[0054] 按以下的步驟從小鼠血液中提取RNA，以提取的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，通過瓊脂 糖凝膠電泳確認(rèn)源自于RNA的擴(kuò)增片段。
[0055] (RNA提取試劑的制備）
[0056] 制備以下組成的RNA提取試劑。
[0057] 氯化鋰、75mMTAPS(pH8. 0)、2. 25mMCaCl2、15mMMgCl2、175mM乙醇酸、5mM脫氧膽 酸、50mMEDTA、0. 05%TritonX-100
[0058] 以氯化鋰為 0M、0. 1M、0. 2M、0. 5M、1. 0M、2. 0M、3. 0M、4. 0M、5. 0M、6. 0M、7. 0M的濃度 制備RNA提取試劑。
[0059] (RNA的提?。?br>[0060] 從小鼠采集血液。使用肝素作為抗凝劑。在該小鼠血液2y1中添加RNA提取試 劑18y1，在75°C下孵化5分鐘。將孵化后的溶液冷卻至室溫后，添加2y1的DNaseI(相 當(dāng)于lOUnits的量），以42°C/5分鐘一75°C/10分鐘孵化。
[0061] (RT-PCR)
[0062] 將上述制備的RNA試樣冷卻至室溫，以其為模板進(jìn)行RT-PCR，得 到源自于被分析物的核酸的擴(kuò)增片段。RT-PCR以H3F3AmRNA為靶向， 將正向引物？1(5'-660：1^(：11^0^(：0^厶厶-3;'序列號1)、反向引物 R1 (5' -GCAAGAGTGCGCCCTCTACTG-3 序列號 2)用作引物組。RT-PCR使用PrimeScript 一步法RT-PCR試劑盒Ver. 2 (Takarabio公司制）相對于反應(yīng)溶液添加上述制備的RNA試樣 2%容量進(jìn)行。反應(yīng)在50°C/30分鐘的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、94°C/I分鐘的逆轉(zhuǎn)錄酶的失活處理后， 進(jìn)行94°C/15秒鐘一62°C/15秒鐘一72°C/15秒鐘的PCR循環(huán)30個循環(huán)。另外，為了確 認(rèn)擴(kuò)增片段不是源自于DNA，作為陰性對照，在不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的情況下，進(jìn)行94°C/15 秒鐘一60°C/15秒鐘一72°C/15秒鐘的PCR循環(huán)30循環(huán)。接著，基于常規(guī)方法將RT-PCR 產(chǎn)物供與瓊脂糖凝膠電泳，對擴(kuò)增片段進(jìn)行可視化。
[0063] 將通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行可視化的擴(kuò)增片段的結(jié)果示于表1。在使用氯化鋰濃 度為0. 5~5. 0M的RNA提取試劑的情況下，僅確認(rèn)到RT-PCR時的擴(kuò)增片段，可知可適當(dāng)?shù)?提取RNA。
[0064] [表 1]
[0065]
[0066] + :有擴(kuò)增
[0067] -:無擴(kuò)增
[0068] [實(shí)施例2]
[0069] 按以下的步驟從小鼠血液中提取RNA，以提取的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，通過瓊脂 糖凝膠電泳確認(rèn)源自于RNA的擴(kuò)增片段。
[0070] (RNA提取試劑的制備）
[0071] 制備以下組成的含有堿金屬鹽的RNA提取試劑。
[0072] 0? 7M堿金屬鹽、75mMTAPS(pH8. 0)、2. 25mMCaCl2、15mMMgCl2、175mM乙醇酸、5mM 脫氧膽酸、50mMEDTA、0. 05%TritonX-100
[0073] 作為堿金屬鹽，使用氯化鋰、溴化鋰、碘化鋰、氯化鈉、碘化鈉、氯化鉀、碘化鉀、氯 化銣、氯化銫、醋酸鋰、磷酸二氫鈉、酒石酸鈉、硝酸鈉、醋酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鉀。
[0074] 另外，使用氯化鋰作為堿金屬鹽，制備省略了作為表面活性劑的脫氧膽酸的RNA 提取試劑。
[0075] (RNA的提?。?br>[0076] 使用制備的RNA提取試劑，通過與實(shí)施例1同樣的方法從小鼠采集血液，提取RNA。
[0077] (RT-PCR)
[0078] 通過與實(shí)施例1同樣的方法，以上述提取的RNA試樣為模板進(jìn)行RT-PCR，得到源自 于各被分析物的核酸的擴(kuò)增片段。
[0079] 將通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行了可視化的有無擴(kuò)增的研究結(jié)果示于表2。在使用含 有堿金屬鹽的RNA提取試劑的情況下，僅確認(rèn)到RT-PCR時的擴(kuò)增片段，可知可適當(dāng)?shù)靥崛?RNA。另外，在使用含有堿金屬鹽中的堿金屬鹵化物的RNA提取試劑的情況下，RT-PCR中的 擴(kuò)增效率較高。另外，可知這些RNA提取試劑不抑制DNaseI處理及RT反應(yīng)、PCR。
[0080] [表 2]
[0081]
[0082] + :有擴(kuò)增_ :無擴(kuò)增
[0083] [比較例1]
[0084] 按以下步驟從小鼠血液中提取RNA，以提取的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，通過瓊脂糖 凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段。
[0085] (RNA提取試劑的制備）
[0086] 制備以下組成的含有強(qiáng)離液物質(zhì)或者多價金屬鹽或者銨鹽的RNA提取試劑。
[0087] 0. 7M強(qiáng)離液物質(zhì)或者多價金屬鹽或者銨鹽、75mMTAPS(pH8. 0)、2. 25mMCaCl2、 15mMMgCl2、175mM乙醇酸、5mM脫氧膽酸、50mMEDTA、0.05%TritonX-100
[0088] 作為強(qiáng)離液物質(zhì)，使用硫氰酸胍、鹽酸胍、尿素。作為多價金屬鹽，使用氯化鎂、氯 化鈣、氯化鎳、氯化錳。作為銨鹽，使用磷酸氫二銨。另外，制備不含作為RNA保護(hù)劑的鹽而 僅含表面活性劑的RNA提取試劑。
[0089] (RNA的提取）
[0090] 使用制備的RNA提取試劑，通過與實(shí)施例1同樣的方法從小鼠采集血液，提取RNA。
[0091] (RT-PCR)
[0092] 通過與實(shí)施例1同樣的方法，以上述提取的RNA試樣為模板進(jìn)行RT-PCR。
[0093] 將通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行可視化了的擴(kuò)增片段的結(jié)果示于表2。在使用多價金 屬鹽的情況下，在RT_PCR、PCR中均未確認(rèn)到擴(kuò)增片段。由此可知多價金屬離子不以RNA保 護(hù)劑起作用或者抑制酶反應(yīng)。簡言之，在本體系中，多價陽離子不優(yōu)選作為RNA提取試劑 的添加劑。在使用強(qiáng)離液物質(zhì)、銨鹽的情況下，在RT-PCR、PCR中可確認(rèn)到擴(kuò)增片段。由此 可知可通過強(qiáng)離液物質(zhì)及銨鹽抑制DNaseI處理。簡言之，在本體系中，強(qiáng)離液物質(zhì)及銨 鹽不優(yōu)選作為RNA提取試劑的添加劑。在不含作為RNA保護(hù)劑的鹽的情況下，RNA分解，在 RT-PCR、PCR中均未確認(rèn)到擴(kuò)增片段。
[0094] [比較例2]
[0095] 按以下步驟從小鼠血液中提取RNA，以提取的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，通過瓊脂糖 凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段。
[0096] (RNA提取試劑的制備）
[0097] 制備以下組成的不含表面活性劑的RNA提取試劑。
[0098] 0? 7M氯化鋰、75mMTAPS(pH8. 0)、2. 25mMCaCl2、15mMMgCl2、50mMEDTA
[0099] (RNA的提?。?br>[0100] 使用制備的RNA提取試劑，通過與實(shí)施例1同樣的方法從小鼠采集血液，從被分析 物中提取RNA。
[0101] (RT-PCR)
[0102] 通過與實(shí)施例1同樣的方法，以上述提取的RNA試樣為模板進(jìn)行RT-PCR。
[0103] 將通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行可視化的擴(kuò)增片段的結(jié)果示于表2。在使用不含表面 活性劑的RNA提取試劑的情況下，在RT-PCR、PCR中確認(rèn)到擴(kuò)增片段。這是因?yàn)椴缓砻婊?性劑，由此被分析物未完全溶解，無法通過DNaseI除盡DNA。
[0104] [實(shí)施例3]從培養(yǎng)細(xì)胞中提取RNA
[0105] 按以下步驟從人培養(yǎng)細(xì)胞即HEK293T細(xì)胞及Jurkat細(xì)胞中提取RNA，通過瓊脂糖 凝膠電泳確認(rèn)其存在。
[0106] (RNA提取試劑的制備）
[0107] 制備以下組成的含有氯化鋰的RNA提取試劑。
[0108] 0? 7M氯化鋰、75mMTAPS(pH8. 0)、2. 25mMCaCl2、15mMMgCl2、175mM乙醇酸、5mM脫 氧膽酸、50mMEDTA、0.05%TritonX-100
[0109] (RNA的提?。?br>[0110] 離心分離l〇3~10 5個培養(yǎng)細(xì)胞，以顆粒的形式回收。在該細(xì)胞顆粒中添加RNA提 取試劑18y1，在75°C下孵化5分鐘。將孵化后的溶液冷卻至室溫后，添加2y1的DNase I(lOUnits分），以 42°C/5 分鐘一75°C/10 分鐘孵化。
[0111] (RT-PCR)
[0112] 將上述提取的RNA試樣冷卻至室溫，以各自為模板進(jìn)行RT-PCR，得 到源自于細(xì)胞的核酸的擴(kuò)增片段。RT-PCR以ACTBmRNA為靶向，將正向引物 F2(5' -AGATGGCCACGGCTGCT-3' ；序列號 3)、反向引物R2(5' -AACCGCTCAITGCCAATGG-3' ；序 列號4)用作引物組。RT-PCR使用PrimeScript-步法RT-PCR試劑盒Ver. 2(Takarabio 公司制）相對于反應(yīng)溶液添加上述制備的RNA試樣2%容量進(jìn)行。反應(yīng)在50°C/30分鐘的 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、94°C/I分鐘的逆轉(zhuǎn)錄酶的失活處理后，進(jìn)行94°C/15秒鐘一60°C/15秒鐘 -72°C/15秒鐘的PCR循環(huán)30循環(huán)。另外，作為陰性對照，在不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的情況下， 進(jìn)行94°C/15秒鐘一60°C/15秒鐘一72°C/15秒鐘的PCR循環(huán)30循環(huán)。接著，基于常規(guī) 方法將RT-PCR產(chǎn)物供與瓊脂糖凝膠電泳，對擴(kuò)增片段進(jìn)行可視化。
[0113] 將通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行可視化的擴(kuò)增片段示于圖1。在將HEK293T細(xì)胞、 Jurkat細(xì)胞設(shè)為被分析物的情況下，均確認(rèn)到特異性擴(kuò)增片段，可知可適當(dāng)?shù)靥崛NA。
【主權(quán)項】
1. 一種用于提取生物試樣中的RNA的試劑，其包含堿金屬鹽及表面活性劑。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑，其中，堿金屬鹽為堿金屬鹵化物。3. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑，其中，堿金屬鹽為氯化鋰。4. 如權(quán)利要求1~3中任一項所述的試劑，其中，表面活性劑含有乙醇酸類。5. 如權(quán)利要求4所述的試劑，其中，表面活性劑還含有脫氧膽酸類。6. -種RNA提取試劑盒，其具有權(quán)利要求1~5中任一項所述的試劑。7. -種提取生物試樣中的RNA的方法，該方法包括：使用權(quán)利要求1~5中任一項所 述的試劑或權(quán)利要求6所述的RNA提取試劑盒。
【專利摘要】本發(fā)明的課題在于，提供一種比現(xiàn)有方法更簡便地制備可供試于酶反應(yīng)的RNA的方法。提供一種用于提取生物試樣中的RNA的試劑，其含有堿金屬鹽及表面活性劑。
【IPC分類】C12N15/09, C12Q1/68
【公開號】CN105143449
【申請?zhí)枴緾N201380055893
【發(fā)明人】佐野創(chuàng)太郎, 宮本重彥, 友野潤, 平塚哉
【申請人】株式會社鐘化
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2013年10月25日
【公告號】EP2913399A1, WO2014065395A1