一種提高釀酒酵母對纖維素水解液抑制物耐受性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種過表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ADPl提高釀酒酵 母對纖維素水解液抑制物耐受性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 石油、天然氣、煤炭等化石型能源的不可再生性嚴(yán)重威脅我國社會的可持續(xù)發(fā) 展，W可再生的生物質(zhì)能源替代不可再生的化石能源，擺脫對石油的依賴，實(shí)現(xiàn)工業(yè)原材 料的根本轉(zhuǎn)變，是我國轉(zhuǎn)變經(jīng)濟(jì)增長模式、保障社會經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的重大戰(zhàn)略需求怔ai FW,AndersonWA,Moo-YoungM.Ethanolfermentationtechnologiesfromsugarand starchfeedstocks.BiotechnolAdv, 2008, 26:89-105]D燃料乙醇是目前開發(fā)最快的生 物質(zhì)能源，它自身含氧量高，既可W作為燃料直接使用，也可W與汽油或柴油^一定比例 纔合使用。燃料乙醇因其具有較高的辛焼值[ChaudhariAB，DandiND,VadnereNC，et al.Bioethanol:acriticalappraisal.Oxford:TheHaworthPress，2004:793-824.]，無 毒，是公認(rèn)的最有可能替代化石能源的環(huán)境友好型生物質(zhì)能源之一。纖維素燃料乙醇由于 其原料來源廣泛，價格化廉，且不與人爭糧，不與糧爭地等特點(diǎn)受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān) 注。
[0003] 纖維素原料主要由纖維素、半纖維素W及木質(zhì)素組成，各組分之間通過共 價鍵和氨鍵緊密結(jié)合，結(jié)構(gòu)復(fù)雜出aiyanYang,QianQien,KunWanga,Run-Cang Sun.Correlationbetweenhemicelluloses-removal-inducedhydrophilicity variationandthebioconversionefficiencyofIignocelluloses:Bioresource Technology, 2013(147) :539 - 544. ]D酵母菌不能直接利用纖維素、半纖維素等組分，因 此需要對纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理和水解將其轉(zhuǎn)化成酵母可直接利用的單糖。然而，當(dāng)前 高效的纖維素預(yù)處理方法（如蒸汽爆破法，酸法，堿法等）在處理過程中都會產(chǎn)生多種抑 制物，影響酵母菌的后續(xù)發(fā)酵過程[Palmqvist,E.andHahn-Hagerdal,B.Fermentation ofIignocellulosichydrolysates.II:inhibitorsandmechanismsofinhibition. BioresourceTechnology, 2000, 74(1) :25-33. ]D纖維素水解液中的抑制物主要有S類： 弱酸（如甲酸、乙酸等），巧喃酸類（如磯酸，5-鞋甲基磯酸等），m類化合物（如4-水楊 酉堇，苯?}等）[PalmqviSt,E.andHahn-Hagerdal,B. .FermentationofIignocellulosic hydrolysates. 11:inhibitorsandmechanismsofinhibition.Bioresource Technology, 2000, 74(1) :25-33.]。弱酸類抑制物主要通過引起胞內(nèi)環(huán)境酸化和陰離子 積累，從而降化生物量，降化乙醇產(chǎn)率等[RussellJB.Anothere邱Ianationfor化e toxicityoffementationacidsatlowPH:anionaccumulationversusuncoupling. JpplBacreriol，1992,73:363-370.]D巧喃類化合物對細(xì)胞代謝過程中重要的酶（如己 糖激酶等）有抑制作用，有研究表明磯酸可W使細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量增加，對細(xì)胞產(chǎn)生毒 害作用D[Allen，S.A.，Clark，W.，McCaffery,J.M.，etal.，F(xiàn)urfuralinducesreactive oxygenspeciesaccumulationandcellulardamageinSaccharomycescerevisiae. Biotechnology for Biofuels, 2010:1754-6834.]，酪類化合物對酵母的毒性最大，主要通 過對細(xì)胞膜的損傷（影響細(xì)胞膜的完整性和選擇透過性等）來影響細(xì)胞代謝。因此，獲得 對抑制物耐受性提高的工業(yè)酵母對于纖維素乙醇的發(fā)展和推廣至關(guān)重要。
[0004]ABC(ATP-bindingcassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一種廣泛存在于各種生物中的核酸結(jié) 合蛋白[JamieSnider,AsadH曰nif,HMappingthefunction曰IyeastABCtransporter interactome,化tChemBiol.2013 ;9(9)]，其中釀酒酵母大約含有30種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， 根據(jù)其核酸結(jié)合區(qū)域的不同分屬于ABCB，ABCC，ABCD，和ABCG四個亞族，然而關(guān)于運(yùn)些轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白的功能研究還不是很清楚[Jungwirth,H. ,Kuchler,K.化asttransporter-atale ofsex,stress,化Ugsandaging.陽BSLett. 2006, 580, 1131-1138]。ADPl是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白的一種，通常被認(rèn)為是一種"多藥物/溶劑"排出累基因，推測其可能與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過 質(zhì)子動力排出胞內(nèi)有毒物質(zhì)的功能相關(guān)[Rojas,A.,Duque,E.etal.T虹eeeffluxpumps 曰rerequiredtoprovideefficienttolerancetotolueneinPseudomoasputid曰 DOT-TIE.Bacteriol，2001 :183:3967-3973]。但是，ADPl基因在纖維素水解液抑制物耐受 性方面的研究還很少，沒有關(guān)于該基因提高釀酒酵母抑制物耐受性的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的在于利用基因工程的方法，構(gòu)建過表達(dá)ADPl基因的重組釀酒酵母， 使其能夠在含有纖維素水解液抑制物的條件下直接發(fā)酵底物生產(chǎn)乙醇，解決纖維素水解液 中抑制物對酵母發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面影響的問題。
[0006] 所述的過表達(dá)的目的基因是ABC(ATP-bindingcassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ADP1，來 源于供體菌S.cerevisiae959基因組；所述ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ADPl基因序列的Genebank登錄 號為NMOOl178724. 1。
[0007] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：通過過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ADPl的方法為在釀酒酵母 中導(dǎo)入含有ADPl基因的多拷貝質(zhì)粒載體構(gòu)建陽性重組菌株，實(shí)現(xiàn)目的基因的過表達(dá)，從而 提高其對纖維素水解液抑制物的耐受性。
[0008] 本發(fā)明實(shí)施例中所用多拷貝質(zhì)粒載體為PRS424,此處所述的多拷貝質(zhì)粒載體還有 多種，如pRS系列，如PRS424、pRS324、PRS414、PYES2.0系列等。只要能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的 過表達(dá)的附加型載體或整合表達(dá)載體都在本發(fā)明保護(hù)內(nèi)。
[0009] 本發(fā)明的實(shí)施例中還在多拷貝質(zhì)粒載體中導(dǎo)入了強(qiáng)啟動子基因，所述的強(qiáng)啟動 子為3-憐酸甘油酸激酶基因（3-phosphoglyceratekinase)啟動子PGK;其基因序列 的Genebank登錄號為服006937. 1。對于本研究領(lǐng)域的研究人員來說，顯而易見，啟動 子可換用其他在釀酒酵母中具有較強(qiáng)活性的啟動子如A畑（乙醇脫氨酶），GAL(半乳糖巧 酶），TPSl(海藻糖合成酶基因）。
[0010] 本發(fā)明使用的受體菌株為模式菌株釀酒酵母菌株S.cerevisiae 959,顯而易見， 其他的模式菌株酵母菌株如S.cerevisiae280或工業(yè)用酵母菌株也可實(shí)現(xiàn)。
[0011] 本發(fā)明的實(shí)施例中最終構(gòu)建的陽性重組菌株為S.cerevisiae959/ADP。其具體是 通過分子生物學(xué)方法將PGK基因和ADPl基因插入過表達(dá)載體PRS424中，再將構(gòu)建好的過 表達(dá)載體用熱激法導(dǎo)入E.COliD冊a中，其篩選標(biāo)記為Amp抗性基因。從大腸桿菌中提取 質(zhì)粒，經(jīng)過酶切驗證后，W醋酸裡轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入菌株S.cerevisiae959中，實(shí)現(xiàn)目的基 因的過表達(dá)。其中，大腸桿菌培養(yǎng)、感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化等基因工程操作均為常規(guī)操作方法， 可W參照《分子克隆實(shí)驗指南》（J.Sambrook,etal.第二版，1996)。
[0012] 本發(fā)明為模式釀酒酵母菌株中攜帶目的基因的多拷貝游離質(zhì)粒的過表達(dá)實(shí)驗。啟 動子PGK和目的