国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      一種提高釀酒酵母對纖維素水解液抑制物耐受性的方法_2

      文檔序號:8937775閱讀:來源:國知局
      基因ADPl之間通過NotI酶切位點連接,PGK-ADPl組合片段通過SacI和 化Ol酶切位點與過表達載體連接,表達載體通過色氨酸營養(yǎng)缺陷型標記進行篩選。
      [0013] 本發(fā)明所述的纖維素水解液抑制物是甲酸、乙酸或慷醒。即本發(fā)明實施例的結果 證明獲得的陽性重組菌株S.cerevisiae959/ADP具有對甲酸、乙酸和慷醒的抗性。
      [0014] 本發(fā)明的有益成果是,通過本方法構建的過表達菌株與其空載對照菌株相比具 有更高的纖維素水解液抑制物耐受性,在分別含有甲酸(1.Og/L),乙酸化Og/L),慷醒 (1. 8g/L)的YNB培養(yǎng)基中的發(fā)酵性能與其對照菌株相比都有明顯提高。
      【附圖說明】 陽01引圖1為PGK啟動子的基因序列及其酶切驗證電泳圖譜。
      [0016] 圖2為目的基因ADPl的基因序列及其酶切驗證電泳圖譜。
      [0017] 圖3為含有1.Og/L甲酸的條件下過表達菌株和對照菌株發(fā)酵性能對比圖。
      [0018] 圖4為含有1. 8g/L慷醒的條件下過表達菌株和對照菌株發(fā)酵性能對比圖。
      [0019] 圖5為含有3.Og/L乙酸的條件下過表達菌株和對照菌株發(fā)酵性能對比圖。
      【具體實施方式】
      [0020] 本發(fā)明實施例1~3所設及的生物材料和培養(yǎng)基等試驗材料,如無特殊說明,均 可W由商業(yè)途徑購買或者常規(guī)方法制備獲得,其中:實驗室模式菌株S.cerevisiae959, PRS424載體,E.COliD冊a為本實驗室保存也可W由商業(yè)途徑購買;LB選擇培養(yǎng)基(氯化 鋼 10邑/1,酵母浸粉5g/L,蛋白腺lOg/LAmp100mg/L)、YNB培養(yǎng)基(Arg20mg/L,AsplOOmg/ LGlulOOmg/X,Iso30mg/X,Lys30mg/X,Val150mg/X,Met2〇111邑凡,曲6 50mg/X,Ser 375mg/X,TyrSOmg/Ll'hr200mg/L,Ade40mg/X,His20mg/X,Leu60mg/X,Ura20mg/ LYNB6. 7g/l,葡萄糖20g/L)、YNB/化P+固體培養(yǎng)基(瓊脂粉30g/l,其它成分同YNB培養(yǎng) 基)、種子培養(yǎng)基(葡萄糖30g/l,其它成分同YNB培養(yǎng)基)均經過無菌處理。 陽〇2U 實施例1PGK-ADP1-PRS424過表達載體的構建
      [0022] 根據(jù)啟動子PGK(GenBank:服006937. 1)序列,設計引物沈QIDNO. 1~2 ;根據(jù)目 的基因ADPl(GenBank:NM001178724. 1)序列,設計引物沈QIDNO. 3 ~4。
      [0023]
      [0024]WS.cerevisiae959基因組為模板擴增PGK和ADPl基因。PCR程序:95°C預變 性 5min;94°C30s,55°Clmin,72°C3min,30 個循環(huán);72°C延伸lOmin。PCR產物經膠回收 純化后,PGK片段經SacI和NotI酶切后與經過同樣處理的PRS424載體進行連接。連接 產物轉化E.COliD冊a感受態(tài)細胞,在LB選擇培養(yǎng)基(Amp終濃度為lOOmg/L)上培養(yǎng),挑 取單菌落,小量提取質粒酶切鑒定并進行DNA序列測定,得到空載質粒pRS424-PGK;ADPl片 段經NotI和化Ol酶切后與經過同樣處理的PRS424-PGK載體進行連接,重復上述步驟,得 到過表達載體PRS424-PGK-ADP1。
      [00巧]實施例2S.cerevisiae959的轉化及轉化子驗證 陽0%] 采用醋酸裡轉化法將空載質粒PRS424-PGK和過表達載體PRS424-PGK-ADP1分別 導入S.cerevisiae959的感受態(tài)細胞,于YNB/T巧+固體平板上進行篩選。30°C培養(yǎng)2-3天, 挑選轉化子,提取酵母中質粒,將酵母質粒重新轉化進E.COliD冊a感受態(tài)細胞進行驗證。 1 %瓊脂糖電泳顯示轉化入E.COliD冊a的質粒經SacI和NotI酶切后獲得872bp左右 片段,與PGK大小相符合;經NotI和化OI酶切后獲得3. 15化左右的片段,與ADPl大小 相符合,證明獲得陽性轉化子,酶切圖譜如圖1和2所示。將空載菌株命名為S.cerevisiae 959-PGK,過表達菌株命名為S.cerevisiae959-ADP。
      [0027] 實施例3轉化子在含有抑制物的條件下發(fā)酵性能考察
      [0028]取S.cerevisiae959-PGK和S.cerevisiae959-ADP各 100JiL,接至 50血的YNB 培養(yǎng)基中,30°C培養(yǎng)24h后,按10%接種到種子培養(yǎng)基,然后將種子按初始0成2。> 0. 6接 種分別含有一定濃度抑制物(甲酸1.OgA,乙酸3.OgA,慷醒1. 8g/L)的YNB發(fā)酵培養(yǎng)基 巧Og/L葡萄糖)中,100/250血搖瓶,30°C培養(yǎng),每1化取樣。發(fā)酵液經適當稀釋后,測定菌 體密度(ODeJ;發(fā)酵液SOOOrpm離屯、5min后,上清液用于測定發(fā)酵產物和殘?zhí)呛?。轉化 子S.cerevisiae959-ADP的生物量在各抑制物培養(yǎng)基中均略高于空載對照菌株,降糖速 率和乙醇產率比對照菌株都有明顯提高。
      [0029] 結果:由圖3可W看出,在含有1.Og/L甲酸抑制物的條件下,過表達菌株從1化就 開始消耗葡萄糖生產乙醇,在6化發(fā)酵結束,乙醇含量達到最大17. 5g/L;空載菌株從24h 開始消耗葡萄糖,在7化到達發(fā)酵終點,乙醇產量為17. 2g/l,過表達菌株的延遲期比對照 相比,縮短了 12h;耗糖速率也明顯高于對照菌株。
      [0030]由圖4的結果可W看出,在含有1.8g/L慷醒抑制物的條件下,過表達菌株菌株的 降糖速率和乙醇產率都高于對照菌株。發(fā)酵結束時,過表達菌株的殘?zhí)呛繛?. 5g/l,空載 菌株的發(fā)酵殘?zhí)呛繛?.Ig/L;過表達菌株的乙醇產量為15. 8g/l,空載菌株為13. 3g/l, 比空載菌株提高了 18. 5%。
      [00川圖5的結果反應了兩株菌在含有3.Og/L乙酸的條件下的發(fā)酵情況,從圖中也可W明顯看出過表達菌株無論從降糖速率,殘?zhí)呛浚?3.8g/L和21.5g/L),乙醇產量巧.7g/L 和8. 5g/L)都優(yōu)于對照空載菌株。 陽03引綜上,過表達ABC轉運蛋白基因ADPl的方法可W顯著提高釀酒酵母對纖維素水解 液抑制物(甲酸,乙酸,慷醒)的耐受性。
      【主權項】
      1. 一種提高釀酒酵母對纖維素水解液抑制物耐受性的方法,其特征在于:過表達轉運 蛋白基因ADP1。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法,其特征在于:所述的過表達轉運蛋白基因ADPl的方法 為在釀酒酵母中導入含有ADPl基因的多拷貝質粒載體構建陽性重組菌株。3. 根據(jù)權利要求2所述的方法,其特征在于:所述的多拷貝質粒載體為pRS424、pRS 324、pRS414 或 pYES2. 0。4. 根據(jù)權利要求3所述的方法,其特征在于:所述的多拷貝質粒載體中還導入了強啟 動子基因 ADH、GAL、TPSl 或 PGK。5. 根據(jù)權利要求2所述的方法,其特征在于:所述的釀酒酵母為S. cerevisiae 959、 S. cerevisiae280或工業(yè)用酵母菌株。6. 根據(jù)權利要求2所述的方法,其特征在于:所述的陽性重組菌株為S. cerevisiae 959/ADP〇7. 根據(jù)權利要求1所述的方法,其特征在于:所述的纖維素水解液抑制物是甲酸、乙酸 或糠醛。
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可以高效地獲得對纖維素水解液抑制物耐性顯著提升的釀酒酵母工程菌株的方法。通過過表達ABC(ATP-binding?cassette)轉運蛋白基因ADP1提高釀酒酵母對纖維素水解液中多種抑制物(甲酸、乙酸和糠醛)的抗性。本發(fā)明的方法所構建的ADP1過表達菌株相比于空載對照菌株,在含有1.0g/L甲酸抑制物的條件下,發(fā)酵時間縮短12h;在含有1.8g/L糠醛抑制物的條件下,乙醇產量提高18.5%;在含有3.0g/L乙酸抑制物的條件下,殘?zhí)呛拷档?5.7%。本發(fā)明為解決纖維素乙醇生產中的關鍵問題,提高微生物對纖維素水解液抑制物抗性,提供了重要方法。
      【IPC分類】C12R1/865, C12N1/19, C12N15/81
      【公開號】CN105154348
      【申請?zhí)枴緾N201510473797
      【發(fā)明人】袁文杰, 相瑞娟, 高教琪, 李益民, 侯勝博
      【申請人】大連理工大學
      【公開日】2015年12月16日
      【申請日】2015年8月5日
      當前第2頁1 2 
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
      1