樹突狀細胞抗原負載方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物腫瘤抗原與載體結(jié)合培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種樹突狀細胞抗 原負載方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 樹突狀細胞值emlriticcell，DC)是人體內(nèi)功能最強大的專職抗原呈遞細胞，也 是唯一能刺激初始型T淋己細胞的抗原呈遞細胞，能夠誘導持久有力的特異性抗腫瘤免疫 反應。作為機體免疫應答的始動者，DC在腫瘤免疫、抗感染免疫、免疫排斥等方面的重要作 用已被深入研究。負載抗原的DC疫苗已成功應用于轉(zhuǎn)移性前列腺癌、惡性黑色素瘤、多發(fā) 性骨髓瘤和慢性髓性白血病等腫瘤的治療。
[0003] 樹突狀細胞與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系：
[0004] 1.W腫瘤抗原體外專一性地沖擊致敏、激活抗原呈遞功能最強的樹突狀細胞，可 保證腫瘤抗原被有效攝取。 陽0化]2.樹突狀細胞通過細胞表面高水平的MHCI、II類分子呈遞了豐富的腫瘤抗原 膚，使相應的T細胞受體（TCR)被充分占據(jù)；同時，樹突狀細胞提供高水平的協(xié)同刺激分子 B71(CD80)、B72(CD86)、CD40 等，使T胞被充分激活。
[0006] 3.樹突狀細胞與T細胞結(jié)合后，可W大量分泌IL-12,激發(fā)T細胞增殖，誘導CTL生成，主導了T化型的免疫應答，有利于腫瘤細胞的清除。 陽007] 4.樹突狀細胞還能分泌趨化因子值CCCK)專一性地趨化初始型T細胞，通過促進 T細胞聚集，增強對T細胞的激發(fā)。
[000引然而，人體內(nèi)大部分DC處于未成熟狀態(tài)，共刺激因子和粘附因子表達低水平較 低，體外激發(fā)同種混合淋己細胞增殖反應的能力較低，但未成熟DC具有較強的遷移能力和 極強的抗原吞隧能力，在攝取抗原（包括體外加工的抗原）或受到某些因素刺激時即分化 為成熟DC，而成熟的DC表達高水平的共刺激因子和粘附因子，抗原提呈能力較強，能有效 激活初始型T淋己細胞，誘導特異性的細胞毒性T淋己細胞（巧totoxicTlymphocyte， CTL)生成，啟動抗腫瘤反應。
[0009] DC在血液中僅占單個核細胞總數(shù)的0. 5% -1. 0%，數(shù)量很少，因此，體外培養(yǎng)的DC 對于制備抗腫瘤的DC疫苗具有重要意義。目前DC疫苗的常規(guī)制備方法是將腫瘤抗原加入 底面鋪滿DC的培養(yǎng)瓶中，或者是將DC收集起來懸浮于離屯、管中再加入腫瘤抗原。前者需 要大量的腫瘤抗原；后者DC與腫瘤抗原的接觸面積較低，影響了DC對腫瘤抗原的攝取量， 進而影響DC的抗原提呈效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了解決DC疫苗制備過程中腫瘤抗原使用量大、DC與腫瘤抗原接觸面積較低W致DC攝取腫瘤抗原的數(shù)量較低的問題，本發(fā)明設(shè)計一種樹突狀細胞抗原負載方法，實現(xiàn)節(jié) 約腫瘤抗原的使用量，并且增加DC與腫瘤抗原的接觸面積，提高DC攝取腫瘤抗原的數(shù)量的 目的。
[0011] 實現(xiàn)上述目的技術(shù)方案是，本發(fā)明開發(fā)出的一種樹突狀細胞抗原負載方法，包括 如下步驟：獲取樹突狀細胞，并將其與免疫磁珠結(jié)合后置于磁場中，再加入腫瘤抗原共培 養(yǎng)，得到負載上腫瘤抗原的樹突狀細胞。
[0012]在本發(fā)明提供的樹突狀細胞抗原負載方法中，所述免疫磁珠為攜帶有CD209單抗 的免疫磁珠。
[0013] 在本發(fā)明提供的樹突狀細胞抗原負載方法中，所述免疫磁珠的直徑范圍為 100-300nm。
[0014] 在本發(fā)明提供的樹突狀細胞抗原負載方法中，所述磁場強度小于或等于20mT。
[0015] 在本發(fā)明提供的樹突狀細胞抗原負載方法中，所述腫瘤抗原為結(jié)腸癌抗原、肝癌 抗原和肺癌抗原中任意一種。
[0016] 在本發(fā)明提供的樹突狀細胞抗原負載方法中，所述樹突狀細胞的來源為：從血液 中分離出單個核細胞，經(jīng)體外誘導培養(yǎng)轉(zhuǎn)化成樹突狀細胞。
[0017] 在本發(fā)明提供的樹突狀細胞抗原負載方法中，所述體外誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)液為含體 積分數(shù)為1%PPP、濃度為50ng/mlGM-CSF、濃度為500IU/ml比-4的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
[0018] 在本發(fā)明提供的樹突狀細胞抗原負載方法中，所述共培養(yǎng)步驟中還包括向所述已 負載腫瘤抗原的樹突狀細胞里加入TNF-a、白介素和脂多糖中的一種。
[0019] 在本發(fā)明提供的樹突狀細胞抗原負載方法中，所述TNF-a的濃度為1-lOng/ml、 或白介素的濃度為5-15ng/ml、或脂多糖的濃度為1-lOng/ml。
[0020] 實施本發(fā)明提供的樹突狀細胞抗原負載方法，可W達到W下有益效果：通過加入 免疫磁珠并置于磁場中，增加了樹突狀細胞與腫瘤抗原的接觸面積，進一步促進樹突狀細 胞負載抗原的效率，并且節(jié)約了腫瘤抗原的使用量，提高樹突狀細胞的免疫活性。
【具體實施方式】
[0021] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，W下結(jié)合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限 定本發(fā)明。
[0022] 本發(fā)明提供的一種樹突狀細胞抗原負載方法，包括W下步驟：
[0023] 獲取樹突狀細胞，并將其與免疫磁珠結(jié)合后置于磁場中，再加入腫瘤抗原共培養(yǎng)， 至樹突狀細胞負載腫瘤抗原，獲得負載上腫瘤抗原的樹突狀細胞。
[0024] 本發(fā)明的改進點在于，將樹突狀細胞附著在免疫磁珠上，加入腫瘤抗原，置于磁場 中，通過免疫磁珠在磁場中的運動，增加樹突狀細胞與腫瘤抗原的接觸面積，從而提高了腫 瘤抗原的負載量，縮短了腫瘤抗原的負載時間，提高了腫瘤抗原的負載效率，同時，也節(jié)約 了腫瘤抗原的使用量。 陽0巧]其中，免疫磁珠為攜帶有CD209單抗的CD209免疫磁珠，可W購買自德國美天旋生 物技術(shù)公司生產(chǎn)的CD209免疫磁珠，而樹突狀細胞表面也具有CD209單抗，因此，樹突狀細 胞能夠與免疫磁珠進行結(jié)合，具體操作方法按美天旋公司CD209值C-SIGN)磁珠分選試劑 盒說明書進行操作；另外，優(yōu)選地，免疫磁珠的直徑范圍為100-300皿，通過磁場的作用，能 夠使樹突狀細胞與免疫磁珠充分結(jié)合均勻，便于提高后續(xù)腫瘤抗原的負載量W及縮短腫瘤 抗原的負載時間。由于磁場的強弱會直接影響樹突狀細胞的免疫活性，因此，本發(fā)明中優(yōu)選 的磁場強度為小于或等于20mT，在保持樹突狀細胞活性的同時，也能夠提高腫瘤抗原的負 載效率。
[00%]另外，為進一步提高樹突狀細胞的免疫活性，在樹突狀細胞與腫瘤抗原共培養(yǎng) 時，加入TNF-Q(腫瘤壞死因子-a)、白介素或脂多糖中的一種，培養(yǎng)24h收集得到的細 胞即可；其中，TNF-Q的濃度為1-lOng/ml、白介素的濃度為5-15ng/ml、脂多糖的濃度為 1-lOng/ml。在本發(fā)明優(yōu)選實施例中，優(yōu)先選用TNF-a，在增強樹突狀細胞免疫活性的同時， 能夠進一步穩(wěn)定樹突狀細胞的抗原提呈性。
[0027] 而本發(fā)明中的腫瘤抗原可W是結(jié)腸癌抗原、肝癌抗原、肺癌抗原中的任意一種，其 獲取的具體方法步驟為現(xiàn)有技術(shù)，在此不再寶述。
[0028] 進一步地，本發(fā)明中樹突狀細胞可來源于人體血液，但由于樹突狀細胞在血液中 僅占單核細胞總數(shù)的0. 5-1. 0%，數(shù)量很少；因此，本發(fā)明優(yōu)選實施例中，將單個核細胞通 過體外誘導培養(yǎng)方式，獲取得到樹突狀細胞，具體步驟為：
[0029] 1)從血液中分離出單個核細胞；
[0030] 2)將得到的單個核細胞，用細胞培養(yǎng)液重懸細胞，靜止放置2-化，吸去不貼壁細 胞懸液，獲得分離后貼壁的單個核細胞；
[0031] 3)再加入體外誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)72h，對步驟2)中獲得的貼壁單個核細胞進行擴 增；
[0032] 4)用體外誘導培養(yǎng)液進行半量換液，并將步驟3)中擴增后的貼壁的單個核細胞 定向誘導轉(zhuǎn)化成樹突狀細胞；
[0033] 其中，步驟1)從血液中分離出單個核細胞的具體過程為：
[0034] A、取100mL抗凝處理后的血液，將血液分別加入到4個50ml無菌離屯、管中； 300g離屯、lOmin，離屯、后，將所有的上層血漿轉(zhuǎn)移到2個新的無菌離屯、管中，56 °C水浴滅 活30min，再于400g離屯、IOmin后，收集上層黃色液體即低血小板血漿（PoorPlatelet Plasma,PP巧，4°C儲存?zhèn)溆谩?br>[0035] B、向步驟A中4個下層含血細胞的離屯、管中加入注射用生理鹽水，直到每管含 30ml混合液，并用移液器混勻。
[0036] C、再取4支含15ml淋己細胞分離液的50ml離屯、管，緩慢的將血細胞混合液用移 液器轉(zhuǎn)移到淋己細胞分離液的上層；400g離屯、20分鐘。
[0037] D、離屯、后將中間白膜層吸入到新的50ml離屯、管中；用注射用生理鹽水補液到 45ml后，300g離屯、5分鐘，清洗單個核細胞。
[0038] E、重新加入注射用生理鹽水45ml，混勻后離屯、清洗單個核細胞。
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