39] 步驟2)中的細(xì)胞培養(yǎng)液優(yōu)先采用適宜于單個(gè)核細(xì)胞生長的含80IU/ml硫酸慶大 霉素的DMEM培養(yǎng)液；
[0040] 步驟3)和步驟4)中的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)液優(yōu)選為含體積分?jǐn)?shù)為1 %PPP(低血小板血 漿）、終濃度為50ng/mlGM-CSF(粒-巨隧細(xì)胞因子）、終濃度為500IU/ml比-4(白介素-4) 的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。需要特別注意的是，由于樹突狀細(xì)胞相比非貼壁細(xì)胞其能具有貼壁性，但是 其貼壁性能并不強(qiáng)，而是偏向于半貼壁的類型，因此在步驟4)的培養(yǎng)的過程中需采用半量 換液，W避免將目的樹突狀細(xì)胞吹成懸浮而流失。
[0041] 為使本發(fā)明的上述實(shí)施的技術(shù)細(xì)節(jié)和過程方法能更易于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解 和實(shí)施參考，同時(shí)為突顯出本發(fā)明中腫瘤抗原的負(fù)載效率，W下通過具體的實(shí)施例進(jìn)行舉 例說明。 陽042] 本實(shí)施例中樹突狀細(xì)胞負(fù)載腫瘤抗原的方法為：
[0043] 1、從8-10周180-200g的Wistar大鼠血液中分離出單個(gè)核細(xì)胞； W44] 2、將得到的單個(gè)核細(xì)胞，用20ml含80IU/ml硫酸慶大霉素的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì) 胞，于T75培養(yǎng)瓶中靜止放置2-化，吸去不貼壁細(xì)胞懸液，獲得分離后貼壁的單個(gè)核細(xì)胞；
[0045] 3、在T75培養(yǎng)瓶中加入20ml含體積分?jǐn)?shù)為1 %PPP、終濃度為50ng/mlGM-CSF、終 濃度為500IU/mlIL-4的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)7化后，獲得擴(kuò)增后的貼壁的單個(gè)核細(xì)胞；
[0046] 4、用含體積分?jǐn)?shù)為1%PPP、終濃度為50ng/mlGM-CSF、終濃度為500IU/ml比-4 的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行半量換液，并將步驟3中擴(kuò)增后的貼壁的單個(gè)核細(xì)胞定向誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 成樹突狀細(xì)胞；
[0047] 5、將步驟4中的樹突狀細(xì)胞與攜帶有CD209單抗的免疫磁珠按照美天旋公司 CD209值C-SIGN)磁珠分選試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)合，并置于20mT的磁場(chǎng)中；其中，免疫磁珠 的直徑為150nm; W4引 6、向步驟5中的樹突狀細(xì)胞和免疫磁珠中加入50ug腫瘤抗原，2h后撤去磁場(chǎng)，然 后加入20ul終濃度為20ng/ml的TNF-a，培養(yǎng)24h后收集得到的細(xì)胞即可。 陽049] 其中，腫瘤抗原的制備過程為：
[0050] 1)接種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系
[0051] 取大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基的25cm2塑料 培養(yǎng)瓶中，置37°C，5%C02、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱巾培養(yǎng)，每1-2天換培養(yǎng)基一次。
[0052] 2)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
[0053] 當(dāng)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長至80-90%融合時(shí)，去除原培養(yǎng)基，W5血O.Olmol/L 的PBS溶液連續(xù)漂洗2次，棄去PBS溶液后，加入0. 25 %膜蛋白酶溶液約ImL，室溫靜置 2-3min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞收縮成球形并有部分細(xì)胞脫離器皿時(shí)，立即加入含10%FBS(胎牛血清）的PBS溶液約2-3mL終止消化反應(yīng)；利用吸管輕柔吹打使貼壁細(xì)胞脫落， 并將消化的細(xì)胞懸液移入離屯、管中，室溫離屯、，1000轉(zhuǎn)/分，5min，去掉上清，加入10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕柔吹打形成單細(xì)胞懸液，混勻，按1:2-1:3進(jìn)行傳代 接種于新的培養(yǎng)瓶中，置37°C，5%的C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2-3天傳代一次；
[0054] 如腫瘤抗原的制備 陽化5] 待傳代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，用0. 25%不含邸TA(乙二胺四乙 酸）的膜酶消化，PBS溶液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X1〇9個(gè)/mL,取IOml裝在培養(yǎng)管中； 用美國化docare公司生產(chǎn)的4刀氣氮超導(dǎo)靴向手術(shù)系統(tǒng)，將3min氣氮刀插入盛有膠質(zhì)瘤 細(xì)胞的PBS溶液中，啟動(dòng)超低溫手術(shù)系統(tǒng)，調(diào)整氣氮冷凍設(shè)備功率為100%，凍融2循環(huán) (-140°C、5min-45°C、3min--140°C、5min-45°C、3min),整個(gè)過程嚴(yán)格無菌操作，即獲取 腫瘤抗原。
[0056] 為進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞抗原負(fù)載方法的顯著效果，通過W下實(shí)驗(yàn) 及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行具體說明。
[0057] 一、檢測(cè)對(duì)象： 陽05引A組：取本發(fā)明實(shí)施例1所獲得的負(fù)載腫瘤抗原的DC,調(diào)節(jié)至濃度為5XIO5個(gè)/ml的DC細(xì)胞溶液；
[0059]B組：采用現(xiàn)有腫瘤抗原負(fù)載方法所獲得的負(fù)載腫瘤抗原的DC，在該方法中所采 用的腫瘤抗原負(fù)載前的DC和腫瘤抗原的來源與用量均與本發(fā)明實(shí)施例1相同，具體地： W60] 腫瘤抗原負(fù)載方法為：取50ug的腫瘤抗原加入底面鋪滿DC的培養(yǎng)瓶中，按制備凍 融抗原前腫瘤細(xì)胞數(shù)量與DCs數(shù)量3:1的比例，刺激DC細(xì)胞培養(yǎng)，于培養(yǎng)48小時(shí)后鏡下 觀察到有大量的成熟DC存在時(shí)，加入20ul終濃度為20ng/ml的TNF-a，收集DC細(xì)胞調(diào)整 濃度為5X1〇5個(gè)/ml的DC細(xì)胞溶液。 W61] 二檢測(cè)方法
[0062] 1、樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)記物的檢測(cè)
[0063] 分別對(duì)A、B組中的DC細(xì)胞液執(zhí)行W下操作： 柳64] 用預(yù)冷的0.Olmol/L的PBS清洗DC細(xì)胞，并調(diào)整DC細(xì)胞密度為5x10^10yL在100yL細(xì)胞懸液中分別加入陽標(biāo)記CD86和陽標(biāo)記CD80各5yL在4°C中避光放置 30min，PBS洗涂3次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)率，檢測(cè)結(jié)果見下表1。 陽0化]2、ELISA法檢測(cè)IL-12含量
[0066] 本次檢測(cè)所采用的化ISA試劑盒，保存于4。且由W下成分組成：
[0067] 酶標(biāo)板：96孔、標(biāo)本稀釋液12ml、標(biāo)準(zhǔn)品：2化g、第一抗體工作液12ml、酶標(biāo)抗體工 作液12ml、濃縮洗涂液50ml、底物工作液12mlW及終止液12ml。
[0068] 根據(jù)化ISA試劑盒說明書中所記載的檢測(cè)過程分別對(duì)A、B組的DC上清液中的 IL-12的濃度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見下表1:
[0069] 表 1
[0070]
[0071] 由表1中的檢測(cè)結(jié)果可W看出，采用等量的抗原進(jìn)行DC細(xì)胞的抗原負(fù)載時(shí)，通過 本發(fā)明實(shí)施例1得到的DC細(xì)胞刺激機(jī)體產(chǎn)生的IL-12量W及CD80,CD83的陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高 于現(xiàn)有方法。由此可見，通過本發(fā)明提供的樹突狀細(xì)胞抗原負(fù)載的方法能夠節(jié)約腫瘤抗原 使用量，并且增加DC與腫瘤抗原的接觸面積，提高DC攝取腫瘤抗原的數(shù)量。
[0072] W上所述僅為本發(fā)明最佳的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可W有 各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng) 包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種樹突狀細(xì)胞抗原負(fù)載方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：獲取樹突狀 細(xì)胞，并將其與免疫磁珠結(jié)合后置于磁場(chǎng)中，再加入腫瘤抗原共培養(yǎng)，得到負(fù)載上腫瘤抗原 的樹突狀細(xì)胞。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞抗原負(fù)載方法，其特征在于，所述免疫磁珠為攜 帶有⑶209單抗的免疫磁珠。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞抗原負(fù)載方法，其特征在于，所述免疫磁珠的直 徑范圍為100-300nm。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞抗原負(fù)載方法，其特征在于，所述磁場(chǎng)強(qiáng)度小于 或等于20mT。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞抗原負(fù)載方法，其特征在于，所述腫瘤抗原為結(jié) 腸癌抗原、肝癌抗原和肺癌抗原中任意一種。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞抗原負(fù)載方法，其特征在于，所述樹突狀細(xì)胞的 來源為：從血液中分離出單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化成樹突狀細(xì)胞。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的樹突狀細(xì)胞抗原負(fù)載方法，其特征在于，所述體外誘導(dǎo)培養(yǎng) 的培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)為1% PPP、濃度為50ng/ml GM-CSF、濃度為500IU/ml IL-4的基礎(chǔ) 培養(yǎng)液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞抗原負(fù)載方法，其特征在于，所述共培養(yǎng)步驟中 還包括：向所述已負(fù)載腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞里加入TNF-a、白介素和脂多糖中的一種。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的樹突狀細(xì)胞抗原負(fù)載方法，其特征在于，所述TNF- a的濃度 為l-10ng/ml、或白介素的濃度為5-15ng/ml、或脂多糖的濃度為l-10ng/ml。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種樹突狀細(xì)胞抗原負(fù)載方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：(1)從血液中分離出單個(gè)核細(xì)胞；(2)對(duì)樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)活化及腫瘤抗原負(fù)載。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，通過加入磁珠這種方法，增加了樹突狀細(xì)胞與腫瘤抗原的接觸面積，進(jìn)一步促進(jìn)樹突狀細(xì)胞負(fù)載抗原的效率，并且節(jié)約了腫瘤抗原的使用量，得到最佳的抗原負(fù)載效果。
【IPC分類】C12N5/0784
【公開號(hào)】CN105154403
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510400536
【發(fā)明人】曾憲卓, 魯菲
【申請(qǐng)人】深圳愛生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年7月9日